PEWARNAAN /

PENGECATAN
BAKTERI

Asih Rahayu,drh.,M.Kes.
LAB. MIKROBIOLGI
FK UWKS
 IDENTIFIKASI BAKTERI
Identifikasi bakteri penyebab penyakit infeksi
dilakukan di laboratorium Mikrobiologi dengan
mengirimkan spesimen /sampel / bahan
pemeriksaan penderita (mengenai sampel dibahas
lebih lanjut pada Bab Pengambilan Spesimen &
interpretasi Hasil Pemeriksaan Laboratorium
Mikrobiologi)
Sampel yang diterima oleh lab akan dikerjakan
sesuai permintaan dokter pengirimnya
 PEMERIKSAAN RUTIN LAB
MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERI
Setiap sampel untuk pemeriksaan bakteri yang
diterima oleh lab Mikrobiologi akan dilakukan
pemeriksaan sbb:
1. Pemeriksaan mikroskopis untuk mengetahui
morfologi & sifat afinitas bakteri terhadap zat
warna
2. Kultur (perbenihan) untuk mengetahui sifat
fisiologis & kimiawi bakteri
3. Hewan coba (bila perlu) ; saat ini sudah sangat
jarang dilakukan
 1.PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS
Untuk memeriksa bakteri secara mikroskopis
perlu dilakukan pewarnaan /pengecatan
Jenis pewarnaan yang dipergunakan disesuaikan
dengan kebutuhan / permintaan masing masing
spesimen yang dikirimkan
Umumnya dilakukan pewarnaan rutin lab
Mikrobiologi yaitu Pewarnaan Gram, kecuali
terdapat indikasi lain misalnya untuk spesimen
penderita yang diduga TBC atau lepra , tidak
dilakukan pewarnaan Gram melainkan
pewarnaan Tahan Asam / Acid Fast / Ziehl Nelsen
Terdapat banyak jenis pewarnaan, pada kuliah ini
hanya dipelajari beberapa yang dasar & sangat
penting diketahui oleh seorang calon praktisi /
dokter umum
 PEWARNAAN
berdasarkan ikatan zat
warna dengan sito-
plasma bakteri

POSITIF NEGATIF
-Zat warna dapat ber- -zat warna tidak dapat
ikatan dengan sito- berikatan dengan sito-
plasma bakteri plasma bakteri
 Pewarnaan yang bersifat positif
Karena mempergunakan zat warna yang dapat berikatan
dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop
bakteri akan tampak berwarna sesuai dengan warna zat
yang dipakai
Zat warna yang dipakai harus bersifat basa ( basic dyes)
untuk dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang
cenderung bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat basa:
Crystal violet berwarna ungu
Safranin berwarna merah
Methylene Blue berwarna biru
Carbol fuchsin berwarna merah
Malachite Green berwarna hijau ; larut dalam air
Neisser AB & Neisser C larut dalam air
Macam Pewarnaan yang bersifat positif
Sederhana / simple staining :
mempergunakan 1 macam zat warna basa
tujuannya hanya untuk mengetahui bentuk/morfologi &
susunan bakteri secara cepat
Differential :
dapat membedakan sifat sifat bakteri berdasarkan
afinitas terhadap zat warna
mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa
selain untuk mengetahui bentuk & susunan bakteri juga
untuk mengetahui sifat bakteri berdasarkan afinitas
terhadap zat warna misalnya sifat Gram,sifat Acid fast
Khusus:
mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa;
untuk mengetahui bagian bagian khusus yang dimiliki
oleh bakteri misalnya Granula metachromatic,
endospora / spora, capsule dll
 PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF
Karena menggunakan zat warna yang tidak dapat
berikatan dengan sitoplasma bakteri, maka di
bawah mikroskop bakteri akan tampak bening /
tidak terwarnai / transparan & hanya latar
belakang / daerah di sekitar bakteri yang akan
terwarnai
Zat warna yang dipakai harus bersifat asam /
acidic dyes sehingga tidak dapat berikatan dengan
sitoplasma bakteri yang cenderung bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat asam : tinta bak,
chinese ink, indian ink, nigrosin
 MACAM PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF

Burrie / negative stain :

mempergunakan 1 macam zat warna asam

untuk mengetahui morfologi & susunan

bakteri
umumnya dipakai untuk mewarnai bakteri
bakteri yang sulit diwarnai ( sulit
menyerap zat warna basa )
dapat juga dipakai untuk mewarnai bakteri

bercapsule
 Membuat preparat / sediaan bakteri untuk pewarnaan

Secara detail langkah langkahnya lihat

Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi
Yang perlu diingat adalah :
1. Pakai object glass bersih & bebas lemak (baru)
2. Siapkan ose yang lingkarannya menyatu
3. Siapkan nyala api bunsen
4. Bila bakteri diambil dari biakan cair tidak
perlu PZ steril
5. Bila bakteri diambil dari biakan padat perlu
PZ steril
6. Selalu bekerja secara ASEPTIS
7. Preparat harus difixasi setelah benar benar
kering
 PEWARNAAN SEDERHANA
= SIMPLE STAINING
Mempergunakan 1 macam zat warna basa ; zat warna
yang dianjurkan : safranin atau methylene blue
Di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna
merah bila menggunakan safranin & bila menggunakan
methylene blue, bakteri akan tampak berwarna biru
Secara detail langkah-langkahnya lihat Buku Petunjuk
Praktikum I Mikrobiologi
Informasi yang didapat dari pewarnaan ini hanyalah
morfologi & susunan bakteri
Morfologi : coccus ; batang = bacill panjang, pendek,
sangat pendek, kurus , gemuk, kecil, besar, mempunyai
spora (spora tampak sebagai daerah tak berwarna karena
spora tidak dapat ditembus zat warna) dll
Notes: bentuk batang yang sangat pendek sehingga mirip
coccus disebut sebagai cocoid atau coccobacill
Susunan : bergerombol, membentuk rantai, seperti huruf
cina, berdua, berempat berdelapan, sendiri sendiri dll
 PEWARNAAN GRAM
Merupakan pewarnaan differential untuk
membedakan antara bakteri Gram positif dengan
bakteri Gram negatif berdasarkan afinitas
dinding sel bakteri terhadap zat warna Gram
Gram merupakan nama penemu pewarnaan
ini tulis huruf awal dengan huruf capital
Secara detail langkah langkahnya lihat di Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi
 Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu :
Crystal violet ( berwarna ungu ) sebagai zat
warna utama = main stain & safranin (berwarna
merah) sebagai zat warna pembanding = counter
stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik :
Alkohol absolut = alkohol 95 96 % sebagai
decolorizing agent = peluntur
Mempergunakan zat kimia : lugol (KI3 3%)
sebagai mordant = pemantek = zat yang
membantu pengikatan zat warna Crystal violet
dengan sitoplasma bakteri (Iodine-dye complex)
 Bakteri yang mempunyai struktur dinding
sel peptidoglikan yang tebal
mempertahankan zat warna crystal violet
pada saat pelunturan warna tetap ungu
Gram POSITIF
Bakteri yang mempunyai struktur dinding
sel peptidoglikan yang tipis tidak dapat
mempertahankan zat warna crystal violet
pada saat pelunturan akan mengikat zat
warna pembanding ( safranin) warna
merah Gram NEGATIF
 PEWARNAAN ACID FAST
= Pewarnaan Tahan Asam = Pewarnaan Ziehl-
Neelsen
Ada beberapa metode , diantaranya Ziehl-Neelsen
, Tan Thiam Hok dari nama orang penemunya
Langkah langkah secara detail lihat Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi metode
Ziehl Neelsen
Merupakan pewarnaan diffrential untuk
membedakan antara bakteri yang tahan asam
(Acid Fast) dengan bakteri yang tidak Tahan
Asam ( Non Acid Fast)
Contoh bakteri Acid Fast adalah : Mycobacterium
leprae & Mycobacterium tuberculosis
 Mempergunakan 2 macam zat wana basa yaitu: Carbol
Fuchsin ( wana merah ) sebagai main stain dengan
Methylene Blue ( warna biru) sebagai counter stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik yang kuat
yaitu Alkohol asam (larutan Alkohol + HCl) sebagai
decolorizing agent
Mempergunakan tehnik pemanasan preparat untuk
merenggangkan pori dinding sel / lapisan mycolic acid
bakteri yang bersifat tahan asam , sehingga diharapkan
zat warma Carbol Fuchsin dapat masuk & berikatan
dengan sitoplasma bakteri
Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel mycolic acid
akan mempertahakan zat warna Carbol Fuchsin pada saat
pelunturan Bakteri Acid Fast / bakteri tahan Asam
/BTA berwarna merah
Bakteri yang tidak mempunyai struktur dinding sel
mycolic acid tidak dapat mempertahankan zat warna
Carbol Fuchsin akan mengikat zat warna pembanding
Methylene Blue bakteri tidak Tahan Asam / Non Acid
Fast berwarna biru
 PEWARNAAN SPORA
= Pewarnaan Schaeffer-Foulton nama penemu
pewarnaan ini
Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat
spora (endospora) bakteri
Bakteri yang dapat membentuk spora (suatu
bentuk pertahanan diri/tidak aktif dari bakteri)
misalnya Bacillus sp & Clostridium sp
Letak & diameter spora adalah karakteristik
Letak : central, sub terminal, terminal
Diameter : lebih kecil atau lebih besar dari
diameter bagian vegetatif bakteri
Bentuk spora : bulat atau oval
 Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu :
Malachite Green (warna hijau) sebagai main
stain & safranin (warna merah) sebagai counter
stain
Mempergunakan tehnik pemanasan untuk
merenggangkan dinding spora yang tebal &
impermiable sehingga diharapkan zat warna
Malachite Green dapat menembus dinding spora
warna spora hijau
Karena Malachite Green larut dalam air maka
bagian vegetative bakteri akan melepas warna
malachite green & mengikat warna safranin
bagian vegetative berwarna merah
 PEWARNAAN NEISSER
Merupakan pewarnaan khusus : untuk melihat
granula metachromatic bakteri
Contoh bakteri patogen yang mempunyai granula
metachromatic adalah Corynebacterium diphteriae
Menggunakan 2 macam zat warna basa Neisser
AB & Neisser C (keduanya larut dalam air)
oleh karena itu selama pewarnaan tidak boleh ada
proses pencucian
Secara detail dapat dilihat pada Buku Praktikum
I Mikrobiologi
Granula metachromatik tampak berwarna biru
gelap & sitoplasma bakteri akan tampak kuning
kecoklatan
 PEWARNAAN NEGATIF
= negative stain = Burrie nama penemunya
Menggunakan zat warna asam,umumnya tinta
bak dengan kualitas yang baik
Metode Pembuatan preparat bakteri untuk
pewarnaan negatif berbeda dengan metode
pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan
positif (simple, Gram, Acid Fast, Spora,Neisser)
yaitu dengan tehnik ulas secara detail di Buku
P
Bakteri tampak tidak berwarna (transparant)
dengan latar belakang hitam /gelap
 Catatan:
Pewarnaan yang menggunakan metode
pemanasan preparat : Acid Fast & Spora
Pewarnaan yang menggunakan metode
pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast
(alkohol asam)
Pada pewarnaan dengan metode pemanasan :
selama pemanasan preparat tidak boleh kering &
tidak boleh mendidih
Semua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian
dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada
pewarnaan Neisser
 Staphylococcus sp Gram positif, coccus, umumnya
bergerombol seperti buah anggur
Streptococcus sp Gram positif, coccus , umumnya
berjajar membentuk rantai
Escherechia coli Gram negatif, batang / bacill kecil,
umumnya sendiri sendiri
Bacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora (
tampak transparant pada pewarnaan Gram), batang
besar, umumnya berjajar membentuk rantai
Mycbacterium tuberculosis Batang panjang kurus, Acid
Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol atau sendiri -
sendiri
Mycobacterium leprae Batang panjang kurus, Acid Fast
/ Tahan Asam, umumnya bergerombol membentuk
formasi melingkar seperti potongan melintang cerutu
(globi / globus) atau sendiri sendiri
Preparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan
Asam disimpulkan sebagai BTA positif