Kepada Yth :

Rencana Baca : Rabu, 7 Maret 2018 Pkl : 08.30 WITA

Tempat : RSP Lantai 4 Gedung A Tutorial Imunologi

PEMERIKSAAN ISLET CELL AUTOANTIBODIES (ICA) DENGAN

METODE ENZYME-pLINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Dessy Iriana, Tenri Esa, Uleng Bahrun

Program Studi Patologi Klinik FK UNHAS/RSUP Dr. Wahidin Sudirohusodo,
Makassar

I. PENDAHULUAN
Islet Cell Autoantibodies (ICA) adalah gabungan dari beberapa antibodi
yang berbeda terhadap molekul islet pankreas seperti Glutamic Acid
Decarboxylase Autoantibodies (GADA), Insulin Autoantibody (IAA),
Protein tyrosine phosphatase islet antigen-2 (IA-2) dan Zinc transporter 8
(ZnT-8) yang berfungsi sebagai penanda proses autoimun Diabetes Melitus
(DM) tipe 1. Pemeriksaan ICA dapat digunakan untuk mengklasifikasikan
jenis DM tipe 1 dan dalam mengidentifikasi individu tidak diabetes yang
berisiko menjadi DM tipe I. Pada sebagian besar individu, ICA terdapat pada
penderita yang didiagnosis dengan DM tipe 1 onset baru (> 85%), individu
dengan DM tipe 2 yang baru terdiagnosis (5-10 %), dan kadang-kadang pada
individu dengan DM Gestasional (<5 %).1
Sel islet langerhans memiliki 4 pulau utama yang masing-masing
menghasilkan produk sekret yang berbeda-beda (Gambar 1). Sel β adalah tipe
sel predominan (<60%) yang mensekresikan insulin, sel α yang mensekresi
glukagon (30%), sel δ (<10%) yang mensekresi somatostatin, dan sel keempat
yaitu sel PP yang memproduksi polipeptida pankreas yang terletak pada lobus
posterior pada kepala pankreas (<1 %).2

Gambar 1. Islet pankreas.

(Sumber : Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology 13th Ed, 2016)

Tutorial Imunologi Page 1

 Diabetes Melitus tipe 1 merupakan hasil dari proses destruksi sel β
pankreas melalui suatu proses yang dapat berlangsung dalam beberapa tahun.
Hal ini menyebabkan intoleransi glukosa dan penyakit klinis ketika sebagian
besar sel β telah hancur. Kehancuran ditandai dengan mengedarkan antibodi
ke sel β pankreas dan dengan infiltrasi limfosit mononuklear yang sangat
besar ke pulau langerhans sementara sel β pankreas tetap ada. Sel islet
pankreas lain yaitu sel α yang memproduksi glukagon, sel δ yang
memproduksi somatostatin, serta sel PP yang memproduksi polipetida
pankreas yang terhindar dari proses autoimun tersebut walaupun secara
embriologi dan fungsinya mirip, serta sama-sama mengekspresikan protein-
protein yang hampir sama. 4,5
Sel β pankreas meningkatkan sensitifitas interferon  (IFN-) dan
MHC kelas I, sehingga merangsang penghancuran sel β yang sehat oleh
autoreactive sel T CD8 yang spesifik terhadap antigen sel beta pankreas
akibatnya autoantigen sel β yang dilepaskan ditangkap oleh Antigen
Presenting Cell (APC) dan dipindahkan ke pancreas-draining lymph node
(LN). Sementara itu di perifer, faktor pemicu lingkungan mengakibatkan
perubahan metabolik yang menciptakan suasana proinflmasi dan memperkuat
respon sel T efektor diatas fungsi T regulator (Treg). Dalam suasana pro-
inflamasi tersebut, respon CD4 terhadap autoantigen sel beta mengakibatkan
terjadinya konversi sel limfosit B menjadi sel plasma dan memproduksi
autoantibodi yaitu (Islet Cell Autoantibodies (ICA), Insulinoma-associated
antigen-2 atau Islet Antigen 2 (IA-2), Insulin autoantibodies (IAA), Glutamic
Acid Decarboxylase Autoantibodies (GADA), dan Zinc Transporter 8
(ZnT8). Bila ditemukan 3 dari antibodi tersebut dapat memberikan
kesempatan 88% individu non diabetes menjadi DM tipe 1 dalam jangka
waktu 10 tahun kedepan. 1,5
Konjugat berlabel enzim pertama kali diperkenalkan pada tahun 1966
untuk mendeteksi antigen dalam jaringan. Metode ini merupakan pengembangan
dari sistem deteksi dengan imunofluorescence. Pada tahun 1971, enzim
berlebel antigen dan antibodi dikembangkan sebagai reagen serologi untuk

Tutorial Imunologi Page 2

 pengujian antibodi dan antigen. Teknik ini merupakan prosedur yang paling
banyak digunakan dalam serologi klinis karena fleksibilitas, sensitivitas,
sederhana, efektivitas biaya dan tidak ada bahaya radiasi. Ada dua jenis
sistem pada metode Enzime Immunoassay (EIA) yaitu sistem homogen dan
sistem heterogen. Dalam EIA sistem homogen dipengaruhi oleh aktivitas
enzim dan tidak diperlukan pencucian untuk memisahkan fraksi terikat dan
bebas sehingga tes dapat dilakukan dalam satu tahap dimana semua reagen
ditambahkan secara bersamaan sedangkan sistem heterogen tidak
dipengaruhi oleh aktivitas enzim, sehingga konjugat tidak mempengaruhi
reaksi antigen-antibodi, tetapi membutuhkan pemisahan fraksi bebas dan
terikat dengan sentrifugasi atau penyerapan pada permukaan padat dan
kemudian dilakukan pencucian. Oleh karena itu, prosedur ini memiliki
banyak langkah, contohnya pada metode Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA). 6
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik
deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi spesifik antara
antigen dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda. Prinsip
dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang
teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan
konjugat antibodi atau antigen yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi
dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat
ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan
pembacaan nilai absorbansi pada ELISA plate reader. Metode ELISA terdiri
atas tiga macam yaitu direct ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwich ELISA.7
American Laboratory Products Company (ALPCO)™ ICA ELISA
adalah tes ELISA kualitatif untuk mendeteksi antibodi IgG terhadap sirkulasi
antigen sel islet pankreas. Produk ini menggunakan kelompok antigen
spesifik sel islet yang dimurnikan dalam prosedur ELISA microwell untuk
mendeteksi adanya ICA serum.

II. TUJUAN

Tutorial Imunologi Page 3

 Tes ini bertujuan untuk mendeteksi antibodi IgG terhadap sirkulasi antigen
sel islet pankreas.
III. METODE
A. Pra Analitik 7
1. Persiapan pasien :
Tidak dibutuhkan persiapan khusus
2. Persiapan sampel :
- Sampel yang digunakan adalah sampel serum
- Sampel serum dapat disimpan pada suhu 2-8 ° C.
- Jika sampel tidak dapat dianalisis dalam waktu 24 jam, simpan
sampel serum pada suhu -20 ° C
3. Alat dan Bahan :
a. Nama Kit ICA ELISA, pabrik ALPCO ™
Bahan yang terdapat dalam kit :
i. PLA ICA = ICA- Strip Microwell (dengan dudukannya)
12 strip
ii. CONJ ENZ = Enzim konjugat (Alkaline Phospathase) 2 x
1,0 ml
iii. DIL SPE = Pengencer sampel 1 x 25,0 ml
iv. CONJ ENZ DIL = Pengencer konjugat 1x10,0 ml
v. CTRL REF ICA = Kontrol referensi 1 x1,5 ml
vi. CTRL + ICA = Kontrol positif (serum manusia) 1 x1,5 ml
vii. CTRL - ICA = Kontrol negatif (serum manusia) 1x1,5 ml
viii. SUBS PNPP = Larutan substrat p-nitrophenyl phosphate
1x 15,0 ml
ix. BUF WASH = Wash Buffer 1x 20,0 ml
x. SOLN STP = Stop Solution (1 N NaOH) 1 x 6,0 ml
b. Air terdistilasi atau terdeionisasi.
c. Handuk kertas
d. Parafilm/plastik pembungkus
e. Tabung kaca untuk pengenceran serum

Tutorial Imunologi Page 4

 f. Mikropipet ukuran 10 μl, 50 μl, dan 100 μl.
g. Pencuci plat mikrotiter
h. Pipet 5 ml untuk pengencer konjugat
i. Microplate reader dengan kemampuan absorbansi 405 nm.
4. Persiapan dan penyimpanan reagen :
a. Enzim konjugat
Pipet 5 ml pengencer konjugat ke dalam satu botol yang
mengandung enzim konjugat (konsentrat). Tutup botol dan aduk
rata. Simpan konjugat terdilusi pada suhu 2-8 ° C bila tidak
digunakan. Catat tanggal dilusi pada label. Kadaluarsa raegen 30
hari setelah pengenceran.
b. Penyangga pengenceran sampel
Pipet seluruh isi (25 ml) ke dalam 100 ml air terdistilasi /
terdeionisasi dalam wadah yang sesuai. Campur secara
menyeluruh, beri label pada wadah sebagai pengencer sampel,
dan simpan pada 2-8 ° C. Reagen yang diencerkan stabil sampai
kadaluwarsa yang ditunjukkan pada vial.
c. Larutan cuci
Pipet seluruh isi (20 ml) larutan cuci dan campurkan kedalam 480
ml air terdistilasi/terdeionisasi dalam wadah 500 ml. Campur
secara menyeluruh, lalu beri label dan simpan pada suhu 2-8 ° C.
Larutan stabil sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada vial.
d. Persiapan sampel serum
Pipet secara akurat 10 μl (0,010 ml) sampel serum ke dalam 1,0
ml pengencer sampel kerja dalam tabung kaca yang sudah diberi
label lalu dihomogenkan.

B. Analitik
1. Prinsip Tes

Tutorial Imunologi Page 5

 Campuran antigen pankreas diimobilisasi ke microwell.
Selama masa inkubasi, antibodi dalam serum sampel bereaksi pada
suhu kamar dengan molekul antigen pada microwell. Setelah
menghilangkan bahan serum berlebih / tak terikat, antibodi kambing
spesifik untuk manusia yang berlabel enzim (alkali fosfatase)
ditambahkan ke kompleks antibodi-antigen. Setelah selesai
pencucian secara menyeluruh substrat p-nitrophenyl phosphate
(pNPP) ditambahkan dan warna yang dihasilkan diukur secara
spektrofotometri. Intensitas warna berbanding lurus dengan
konsentrasi ICA pada sampel. Kontrol ICA positif berfungsi sebagai
kontrol kualitas internal dan memastikan hasil yang valid.

Gambar 2. Indirect ELISA

(Sumber : Textbook of Immunology Second Edirion, 2014)

2. Cara Kerja
a. Sejumlah strip microwell yang dibutuhkan untuk pengujian
dipasang pada pemegang yang disediakan.
b. Kontrol negatif sebanyak 100 μl dipipet kedalam microwell C1
dan D1.

Tutorial Imunologi Page 6

 c. Kontrol positif sebanyak 100 μl dipipet kedalam microwell E1
dan F1.
d. Kontrol referensi sebanyak 100 μl dipipet kedalam microwell G1
dan H1.
e. Sampel serum sebanyak 100 μl dipipet kedalam microwell A2
dan B2.
f. Microwell lalu ditutup dengan mengunakan pembungkus
parafilm / plastik dan didiamkan selama 1 jam pada suhu kamar
(25 ° ± 1 ° C).
g. Setelah diinkubasi, larutan dibuang dan dibiarkan kering dengan
cara mengetuk lembut pada handuk kertas.
h. Microwell kemudian dicuci dengan menggunakan botol cuci,
secara hati-hati dan dekantasi penyangga dari microwell.
Prosedur tersebut diulangi hingga dua kali dan dikeringkan
kembali dengan handuk kertas.
i. Ditambahkan sebanyak 100 μl reagen konjugat enzim (alkalin
fosfatase) ke semua microwell kecuali A1 dan B1 lalu inkubasi
kembali pada suhu kamar (25 ° ± 1 ° C) selama satu jam.
j. Setelah diinkubasi, ulangi langkah pencucian (langkah #h) dan
keringkan microwell.
k. Ditambahkan 0,1 ml (100 μl) larutan substrat PNPP ke semua
microwell termasuk A1 dan B1, lalu inkubasi kembali pada suhu
kamar (25 ° ± 1 ° C) selama satu jam
l. Setelah 30 menit ditambahkan 50 μl Stop Solution ke masing-
masing well dengan kecepatan yang stabil tanpa gangguan.
m. Atur mikcoplate reader untuk membaca absorbansi pada 405 nm
sesuai instruksi.
n. Hitunglah data sesuai dengan Perhitungan Data

3. Pasca Analitik
a. Perhitungan Data

Tutorial Imunologi Page 7

 Catatlah pembacaan spektrofotometri Optical Density (OD) pada
unit absorbansi seperti yang ditunjukkan dalam data Sampel ICA.
Contoh ini hanya untuk ilustrasi.
- Hitunglah pembacaan OD rata-rata dari duplikat control
referensi, negatif, positif, dan sampel.
Rata-rata OD: Referensi (RAVE), Negatif (NAVE), Positif
(PAVE), Sampel (SAVE)
- Bagi rata-rata OD sampel dan kontrol positif dan negatif
dengan nilai (RAVE). Ini menghasilkan nilai rasio untuk
masing-masing.

Interpretasi:
Rasio < 0,95 : ICA Rendah
Rasio > 1,05 : ICA Tinggi
Rasio 0,95-1,05 : ICA Meragukan, perlu pengulangan

b. Quality Control
Kontrol positif dan negatif harus dijalankan bersamaan dengan
sampel yang tidak diketahui setiap saat agar hasil valid. Kontrol
negatif harus menunjukkan nilai rasio < 0,95 dan kontrol positif
harus menunjukkan nilai rasio > 1,05.
c. Karakteristik Kinerja
Spesifisitas strip microwell kit yang berlapis antigen dibuat
dengan analisis Western blot yang menggunakan sampel positif
terkonfirmasi untuk IgG antigen sel islet. Sampel dengan
autoantibodi tiroid dan faktor reumatoid terbaca negatif pada ICA
ELISA ini.

d. Signifikansi

Tutorial Imunologi Page 8

 Alat penelitian ini mendeteksi adanya antibodi ICA dalam
serum. Hasil yang diperoleh dengan menggunakan prosedur ini tidak
boleh digunakan untuk diagnosis IDDM.
Simpan sampel positif dan borderline (dalam 5% dari OD Kontrol
Referensi pada suhu -20 ° C. Sampel segar dari individu harus diuji
lagi setiap enam bulan bersamaan dengan sampel serum
sebelumnya.
e. Keterbatasan dan Sumber Kesalahan
1. Meskipun titer ICA yang lebih tinggi akan menghasilkan
pembacaan OD yang lebih tinggi, pengujian ini dirancang
untuk penentuan ICA secara kualitatif saja.
2. Reproduksibilitas tes yang buruk dapat terjadi karena :
- Pelepasan reagen yang tidak konsisten
- Penyimpanan reagen yang tidak tepat
- Pengenceran reagen yang tidak tepat
- Pencucian microwell tidak menyeluruh
- Reagen substrat lama atau terkena cahaya
- Spektrofotometer tidak stabil / rusak
- Kesalahan dalam mengikuti prosedur pengujian.

DAFTAR PUSTAKA

Tutorial Imunologi Page 9

 1. Alvin CP. Diabetes Melitus: Diagnosis, Classification and
Pathophysiology. In: Harrison’s Principles of Internal Medicine 19th
Edition , Editors : Dennis LK, Stephen LH, Larry Jameson, Anthony SF.
McGraw-Hill. 2015. p. 2404
2. Janet LF,MD. Disorder of the Endocrine Pancreas. In : Pathophysiology of
Disease : An Introduction to Clinical Medicine 7th Edition, Editors : Gary
DH, Stephen JM. McGraw-Hill Education. 2014. p.517
3. John EH. Insulin,Glucagon, and Diabetes Mellitus. In : Guyton and Hall
Textbook of Medical Physiology 13th Ed. Elsevier, 2016.p 983
4. Juan CJ,MD. Endocrine Autoimmunity. In: Greenspan’s Basic & Clinical
Endocrinology 10th Edition. Editors : David GG, Dolores S. McGraw-Hill.
2018. p 40
5. John W, Katharine O. Diabetes. In : Oxford Handbook of Endocrinology
and Diabetes Third edition. Oxford University Press. 2014. p 690
6. Sunil KM, Leela KS, Antigen-antibody Reactions. In : Textbook of
Immunology 2nd Edition, Jaypee Brothers Medical Publishers Ltd. 2014.p
68-9
7. Thermo Scientific. ELISA technical guide and protocols. Available at
www.thermo.co,/pierce. Pierce Biotechnology 2010. Accessed on Januari
2018.
8. ALPCO™ Immunoassays. ICA (Islet Cell Antibody) ELISA, Available at
www.alpco.com. 2011 . Accessed on Oktober 2017.

Tutorial Imunologi Page 10