LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEMERIKSAAN SPUTUM dan IDENTIFIKASI BAKTERI

PENYEBAB INFEKSI SALURAN NAPAS

A. Tujuan Praktikum

1. Mahasiswa dapat melakukan pengambilan spesimen sputum

2. Mahasiswa dapat melakukan inokulasi bakteri dari spesimen ke media tumbuh
3. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan ZN
4. Mahasiswa dapat mengidentifikasi morfologi bakteri dari hasil pewarnaan
5. Mahasiswa dapat mengenali dan mengidentifikasi cirri-ciri morfologi bakteri penyebab
infeksi saluran napas

B. Landasan Teori

Pewarnaan Ziehl Neelsen disebut pewarnaan tahan asam karena pada beberapa jenis
bakteri sukar dilakukan pewarnaan, tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk dilunturkan
meskipun dengan menggunakan zat peluntur (decolorizing agent) asam atau alkohol. Yang
termasuk pada golongan bakteri yang sukar dicat adalah dari
genus Mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium
smegmatis).
Bakteri Mycobacterium tuberculosis menyebabkan penyakit TBC. Mycobacterium
tuberculosis adalah bakteri yang berbentuk batang tipis dengan susunan berderet, tahan
asam (Sifat tahan asam ini bergantung kepada integritas selubung lilin yang terdiri dari
mycolic acid, lilin, dan fosfatida . Etil alkohol 95% yang mengandung asam hidroklorida atau
asam-alkohol melunturkan warna semua bakteri kecuali Mycobcterium), tidak dapat
dimasukkan dalam gram positif ataupun negatif, tidak bergerak, obligate aerob,tidak
mempunyai kapsul, tumbuh lambat pada perbenihan sehingga memerlukan waktu
antara 4-6 minggu.
Mycobacterium tuberculosis menyebabkan penyakit TBC yang menyerang paru-paru,
tulang, kelenjar limfa, ginjal, otak dan kadang-kadang kulit. Organ tubuh yang pertama kali
diserang biasanya paru-paru, karena penularan melalui udara pernapasan, baik dari percikan
ludah pada waktu penderita batuk atau bercakap-cakap.
Pada pewarnaan BTA ini,menggunakan 3 macam reagen yang berbeda,yaitu:
1. Carbol Fuchsin
2. Asam Alkohol
3. Methylen Blue

Pemeriksaan Sputum
Pewarnaan ZN
Pewarnaan Gram
Identifikasi bakteri
1. Bacillus Anthrax
2. Staphylococcus Aureus
3. C. Diptheri
4. Klebsiella Pneumonia
5. M. TBC
6. Streptococcus Pneumoiae

C. Alat dan Bahan

Alat :
- Objek glass
- Lampu spiritus
- Pipet tetes
- Mikroskop
- Korek api
- Jarum ose
Reagen :
- Larutan Carbol Fuchsin 0,3 % (ZN 1)
- Larutan Asam alcohol 3 % (ZN 2)
- Larutan Methylen Blue 0,3 % (ZN 3)
Bahan :
- Sputum
- Minyak imersi

D. Cara Kerja
1) Pemeriksaan Sputum
Pemeriksaan ini terutama bertujuan untuk identifikasi Mycobacterium tuberculosa dan
bakteri lain seperti; pneumococcus, coccus Gram positif lain, Bacillus anthraxis,
Klebsiella pneumoniae Prosedur pemeriksaan:
1. Spesimen sputum dibagi menjadi dua, untuk ditanam pada media tumbuh dan untuk
pewarnaan ZN
2. Dengan menggunakan ose bulat, sputum ditanam pada BAP (Blood Agar Plate) dengan
metode streaking/goresan
3. Inkubasi 37ºC selama 24 jam dalam suasana aerob
4. Sisa sputum dikonsentrasikan secara basa atau asam
5. *cara basa: sputum ditambah NaOH 4% dengan perbandingan 1:1, kemudian
ditambah indikator phenol red 0,004%, dihomogenkan 5-10 menit. Selanjutnya
diinkubasi 37oC selama 30-60 menit.
*cara asam: sputum ditambah HCl 1N 10% dengan cara diteteskan sedikit demi
sedikit menggunakan pipet steril sampai warna sputum menjadi ungu atau kuning
muda
6. Hasil yang didapat dari prosedur sebelumnya disentrifuse 2500-300 rpm selama 20-30
menit. Supernatan dibuang, sisakan 0,5-1ml dari pellet. Dari sediaan pellet dilakukan
pengecatan ZN, penanaman pada media LJ dan induksi pada hewan coba

7. Penanaman pada media LJ diinkubasi pada suhu 37oC selama 8 minggu dalam suasana
aerob. Setiap 3 hari diperiksa apakah ada pertumbuhan. Bila kurang dari 2 minggu ada
pertumbuhan kuman, maka dicurigari kuman tersebut adalah Mycobacterium
saprophytis
8. Bila pada media LJ ada pertumbuhan koloni kemudian ditanam pada media cair,
selanjutnya diteruskan dengan pemeriksaan Cord Fermentation Test , Niacin Test, dan
hewan coba
9. Bila pada BAP ada pertumbuhan maka dibuat sediaan dan dicat gram serta ZN.

2) Pewarnaan Sputum
 1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Siapkan objek glass yang bersih dan bebas dari lemak.
3. Sebelum digunakan, panaskan jarum ose atau lidi diatas lampu spiritus agar steril.
4. Ambil sampel (sputum) dengan menggunakan jarum ose yang sudah dipanaskan
tadi.
5. Letakkan diatas objek glass,dan ratakan sampelnya
6. Keringkan sediaan tersebut.
7. Setelah kering, lakukan fiksasi diatas nyala api.
8. Letakkan diatas jembatan pewarnaan dan siap untuk diwarnai.
9. Pipet reagen carbol fuchsin sebanyak 2-3 tetes, dan diamkan selama 3 menit
10. Bilas sediaan tadi dengan air mengalir.
11. Lunturkan (dekolorisasi) dengan menggunakan 2 tetes asam alcohol, diamkan

selama 30 detik.
12. Bilas sediaan dengan air mengalir
13. Pipet reagen methylen blue sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 3 menit.
14. Bilas sediaan dengan air mengalir.
15. Setelah itu, keringkan sediaan.
16. Tetesi immersion oil sebanyak 1 tetes.
17. Amati dibawah mikroskop

E. Hasil

1. Pembuatan preparat dan pewarnaan BTA

Setelah dilakukan pewarnaan ZN, jika hasil BTA (+) akan terlihat basil berwarna
merah, berderet dengan latar belakang biru.

2. Identifikasi Bakteri
Corynebacterium diphtheriae

Morfologi : Basil bergranula

Susunan : U, X, Y
Seperti huruf cina
Pewarnaan : Neisser
Manifestasi Klinis:
- ada pseudomembrane
- sekret mucopurulent
Staphylococcus sp

Bentuk : Bulat
Warna : Ungu
Pewarnaan : Gram
Susunan : Bergerombol spt anggur
Sifat : Gram +
 Streptococcus

Bentuk : Bulat
Warna : Ungu
Pewarnaan : Gram
Susunan : Berderet
Sifat : Gram +

Mycobacterium tuberculosis

Bentuk : Basil (Batang)

Warna : Merah
Susunan : Berderet
Pewarnaan : ZN (Ziehl nelson)
Sifat : Tahan asam
Manifestasi Klinis:
Klebsiella
- Batuk >2 minggu
- Hemoptysis
Bentuk : Basil/batang
- Keringat malam
Warna : Merah
- Nafsu makan berkurang
Susunan : Menyebar
- Berat badan turun
Pewarnaan : Gram
Sifat : Gam -
F. Hasil dan Pembahasan

Gambar diatas merupakan hasil percobaan pewarnaan asam ( Ziehl Neelsen)

menggunakan reagen larutan carbol fuchsin, larutan asam alcohol, larutan methylen blue.
Interpretasinya, tidak ditemukan bakteri tahan asam penyebab TBC ( Mycobacterium
tuberculosis ) karena beberapa faktor :
1. Mycobakteri tidak mudah diwarnai.
 2. Pengambilan sampel (sputum) dilakukan satu hari sebelum penelitian, kemungkinan
bakteri yang terdapat pada sputum mati karena tidak tahan dengan udara luar dalam
waktu tertentu.
3. Cara pengambilan sputum tidak benar. Sehingga sputum yang keluar tidak benar –
benar dari bronkus yang dalam.
4. Kesalahan prosedur pewarnaan yang dilakukan mahasiswa sehingga bakteri tidak
dapat teridentifikasi.

G. Kesimpulan
kesimpulan dari praktikum pemeriksaan sputum yaitu:

1. Pewarnaan pada praktikum ini adalah teknik pewarnaan basil tahan asam yaitu dengan
menggunakan pewarnaan Ziehl Neelsen dengan menggunakan carbol fuchsin 0,3% yang
berfungsi memberi warna merah pada dinding sel, asam alkohol 3% untuk meluruhkan warna
merah dari carbol fuchsin 0,3% dan methylen blue untuk memberi warna latar pada sampel.
2. Tidak ditemukan bakteri tahan asam penyebab TBC ( Mycobacterium tuberculosis ) karena
beberapa faktor :
- Pengambilan sampel (sputum) dilakukan satu hari sebelum penelitian,
kemungkinan bakteri yang terdapat pada sputum mati karena tidak tahan dengan
udara luar dalam waktu tertentu.
- Cara pengambilan sputum tidak benar. Sehingga sputum yang keluar tidak benar
– benar dari bronkus yang dalam.
- Kesalahan prosedur pewarnaan yang dilakukan mahasiswa sehingga bakteri tidak
dapat teridentifikasi.

H. Daftar Pustaka

Brooks, G. F. et al. 2010. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology.

25th Edition. Asia : The McGraw-Hill Companies, Inc. Terjemahan oleh A.W.
Nugroho. et al. 2012. Mikrobiologi Kedokteran Jawetz, Melnick, & Adelberg.
Jakarta : EGC.