BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Insiden penyakit Diabetes Mellitus (DM) semakin lama semakin meningkat, sehingga
merupakan masalah yang cukup serius di Indonesia. Menurut Tjokroprawiro (1998) penyakit
DM ini merupakan salah satu penyakit yang mendapat prioritas untuk diteliti. Menurut Pickup
and Gareth ( 1991 ) menyatakan bahwa semakin lama seseorang menderita DM makin besar
kemungkinannya mengalami komplikasi, terutama penderita DM yang tidak terawat, sehingga
perlu dilakukan diagnosis dini pada phase pre disease. Hal ini mengingat pada fase ini sudah
terjadi destruksi sel beta pankreas dan sampai terjadi penurunan fungsi sel beta, dan adanya
pertanda reaksi autoimmunitas yang dikaitkan dengan kerusakan sel beta.

Pentingnya diadakan diagnosa dini pada pasien DM pada fase pre-disease adalah untuk
mengetahui progesifitas kearah timbulnya destruksi sel beta pankreas dan melakukan tindakan
pencegahan. Hanya pemeriksaan petanda autoimun kerusakan sel beta yang dapat
membedakan kedua keadaan klinis tersebut. Karena harga pemeriksaan ini amat mahal sekitar
150 dolar, maka pemeriksaan anti-GAD65 abs di Indonesia mungkin dapat mengurangi biaya
dan meningkatkan kualitas pelayanan diabetes di Indonesia.

Sejak diketaui GAD65 sebagai target antigenik dari proses autoimun pada penderita DM
Tipe 1 di dalam sel beta pankreas, maka menjadi sangat relevan untuk dikembangkan suatu
reagenprediksi DM tipe 1 berdasarkan keberadaan anyi-GAD65 pada saliva. Aulanni’am, dkk
(2005-2006) telah menghasilkan monoklonal antibodi-GAD65 (Mab-GAD65) dan dapat
mengenali autoantibodi-human-GAD65 yang sebelumnya telah dideteksi positif oleh “kit”
komersial yang merupakan produk pasar luar negeri harganya relatif mahal.

Tantangan utama dalam mengembangkan strategi untuk melawan diabetes tipe 1 (T1D)
adalah bagaimana untuk mengetahui secara pasti kapan untuk berfokus pada intervensi atau
prevensi. Studi intervensi menarget individu segera setelah onset penyakit, bertujuan
mempertahankan fungsi residual sel β dan mempertahankan normoglikemia sekaligus
mengurangi hipoglikemia dan komplikasi jangka panjang. Studi prevensi bertujuan untuk
menghentikan destruksi autoimun dan mencegah onset klinis diabetes tipe 1 (T1D) pada
individu yang berisiko. Studi prevensi dapat dibagi menjadi prevensi primer (pencegahan
1
autoimunitas) dan prevensi sekunder (pencegahan hiperglikemia yang berlebihan pada individu
dengan autoimunitas). Karena T1D adalah penyakit yang merugikan yang terutama menyerang
anak-anak, penting untuk mencari terapi yang memiliki keseimbangan ideal antara efektivitas
dan keamanan.
Terlepas dari debat mengenai desain studi yang optimal, aksi yang cepat (misalnya
prevensi primer) merupakan kesempatan terbaik untuk mengeradikasi T1D secara efektif.
Meskipun studi prevensi cenderung lebih efektif dan membutuhkan terapi yang lebih tidak
agresif dibandingkan intervensi, namun cukup sulit untuk memprediksi penyakit secara akurat.
Selain itu, terapi prevensi awal harus sangat aman karena terapi tersebut akan diberikan
kepada orang yang sebenarnya tidak akan pernah mengalami T1D. Di samping itu, kebanyakan
subyeknya adalah populasi yang rentan, yaitu anak-anak. Dari waktu ke waktu, identifikasi
penyakit menjadi makin mudah pada individu berisiko yang menunjukkan adanya penanda
autoimun.
Berbeda dengan studi prevensi, studi intervensi pada pasien dengan T1D yang baru
terdiagnosis memiliki lebih sedikit hambatan, terutama karena tidak adanya kebutuhan untuk
mengidentifikasi subyek. Penanda autoimun mengkonfirmasi adanya T1D, dan karena
diagnosis diabetes klinis sudah dibuat, subyek seringkali lebih tertarik untuk berpartisipasi
dalam uji klinis. Sehingga, dengan adanya massa sel-β yang terbatas dan adanya autoimunitas,
kunci dalam mendesain usaha untuk melawan T1D terletak pada penemuan keseimbangan
antara efektivitas dan keamanan; dokter perlu mengintervensi pada tahap yang cukup awal
dengan terapi yang efektif, namun aman. Terapi berisiko tinggi digunakan dalam studi intervensi
yang populasi targetnya lebih sedikit (yaitu mereka dengan T1D) dan membutuhkan waktu yang
lebih singkat untuk mendokumentasikan efektivitasnya. Untuk memastikan keseimbangan
antara risiko dan manfaat, agen dengan potensi efek samping yang signifikan (misalnya terapi
modulasi imun dan terapi imunosupresif) saat ini digunakan pada pasien dengan onset baru,
sedangkan studi prevensi menggunakan terapi berisiko rendah yang diaplikasikan pada
populasi yang lebih luas.
Insulin dipercaya sebagai autoantigen awal dan utama pada T1D. Studi pada mencit
nonobese diabetic (NOD) dan studi perintis pada manusia menunjukkan bahwa paparan awal
terhadap insulin oral efektif dalam mencegah diabetes dan dapat memicu toleransi imun. DPT-1
bertujuan untuk meneliti apakah efek imunomodulator dari paparan insulin berulang, baik
subkutan maupun oral, dapat mencegah atau menunda onset diabetes. DPT-1 adalah salah
satu uji acak multicenter dengan kontrol plasebo yang bertujuan untuk mencari prevensi T1D.
Usaha skrining besar-besaran melibatkan 3500 individu dengan autoantibodi sitoplasmik sel
2
islet dengan atau tanpa autoantibodi insulin (IAA) positif dari skrining pada lebih dari 100.000
anggota keluarga derajat pertama dan kedua dari pasien T1D. Dari jumlah tersebut, 339 terlibat
dalam kelompok insulin parenteral dan 372 pada kelompok insulin oral. Kedua bentuk insulin
tersebut terbukti aman, namun baik insulin oral maupun subkutan tidak menunjukkan
efektivitas.2 Yang menarik, observasi post hoc dari data DPT-1 menunjukkan bahwa pasien
yang berisiko, dengan titer IAA yang lebih tinggi (>80 nU/mL) dan yang menerima insulin oral,
mengalami penundaan onset penyakit selama 5 hingga 10 tahun, suatu efek yang masih ada
bahkan setelah penghentian terapi insulin oral.2 Untuk memfasilitasi studi di masa yang akan
datang, diciptakan TrialNet, suatu konsorsium multicenter yang didanai terutama oleh National
Institutes of Health. TrialNet saat ini akan melakukan studi follow up untuk menentukan apakah
insulin oral dapat menunda onset T1D pada individu dengan risiko menengah dengan dua atau
lebih autoantibodi islet, termasuk IAA (NCT00419562). Hampir 20.000 anggota keluarga
diskrining tiap tahunnya melalui studi TrialNet Pathway to Prevention, namun dibutuhkan usaha
yang berkelanjutan untuk memastikan bahwa sejumlah besar subyek yang dibutuhkan untuk uji
prevensi ini dapat diidentifikasi secara efisien (NCT00097292).
Finnish Diabetes Prediction and Prevention Project meneliti penggunaan insulin
intranasal pada subyek dengan autoantibodi positif yang berusia sangat muda dan secara
genetik berisiko. Insulin intranasal terbukti aman namun tidak efektif (NCT00223613).
Australian Intranasal Insulin Trial (INIT) I, suatu studi keamanan yang dilakukan pada orang
dewasa, mengkonfirmasi bahwa paparan terhadap insulin intranasal menyebabkan perubahan-
perubahan imun yang konsisten dengan toleransi mukosal terhadap insulin, yang berpotensi
menyebabkan insulin bertindak seperti vaksin.7 INIT II mengevaluasi efektivitas dari insulin
intranasal dalam dosis yang lebih tinggi (440 IU insulin per hari selama 7 hari, kemudia
diberikan tiap minggu selama 12 bulan, serta melibatkan subyek yang lebih tua, berusia 4-30
tahun). Studi tersebut bertujuan untuk menentukan apakah insulin intranasal dapat mencegah
destruksi sel-β pada individu yang berisiko (NCT00336674). Pada pasien dengan diabetes
autoimun laten pada dewasa, insulin nasal berhubungan dengan penurunan respon sel-T,
menunjukkan bahwa mungkin terdapat efek imunologis dari insulin intranasal yang
membutuhkan penelitian lebih lanjut.2
Tujuan studi Primary Intervention with Oral Insulin for The Prevention of T1D Trial (Pre-
POINT) adalah untuk mengevaluasi apakah insulin dapat menunda atau bahkan mencegah
autoimunitas dan T1D.2 Studi lain yang menggunakan imunoterapi insulin rantai-B pada pasien
yang baru terdiagnosis T1D meunjukkan adanya respon sel-T spesifik terhadap insulin yang

3
aktif secara nonmetabolik, namun tidak terdapat efek terhadap C-peptide bila dibandingkan
dengan plasebo.

1.2 Tujuan
Mini review ini bertujuan untuk membahas tentang antibodi glutamic acid decarboxylase 65
(GAD65) pada diabetes mellitus tipe 1.

4
 BAB II

GLUTAMIC ACID DECARBOXYLASE

2.1 Struktur GAD

Dalam istilah biokimia dasar, dekarboksilase asam L-Glutamat adalah enzim utama
dalam sintesis asam butirat g-amino (GABA) yang merupakan neurotransmiter penghambat
potensial dan komponen penting fungsi neurofisiologis. Hal ini membutuhkan faktor-ko,
pyridoxal 5'-fosfat yaitu (PLP atau vitamin B6 diaktifkan) untuk mengkatalisis reaksi ini. GAD
dan GABA terutama hadir dalam sel-sel saraf 'GABA-ergik' tetapi, yang menarik, GAD / GABA
juga terdeteksi dalam sel dan organ non-saraf tertentu seperti pankreas, di mana GABA
disimpan dalam vesikula sinaptik seperti di sel beta islet. Meskipun relevansi fungsionalnya saat
ini tidak jelas, mungkin terkait dengan efek parakrin dalam modulasi sekresi glukagon di sel
alfa.
Perlu dicatat bahwa istilah GAD pada dasarnya menunjukkan aktivitas enzimatik yang
merupakan bagian dari jalur sintetis kritis. Dalam hal struktur atau fungsi gen atau protein, GAD
melibatkan dua isoform protein utama yang mengkatalisasi sintesis GABA. Satu isoform
memiliki ukuran molekul 65kDa disebut GAD65, sedangkan yang kedua, ukuran 67kDa, disebut
GAD67. Protein ini juga merupakan produk dari gen terpisah yang juga berada di kromosom
yang berbeda. GAD65 adalah produk dari gen yang terletak di Chromosome 10 dan GAD67
pada Chromosome 2. Namun, terlepas dari perbedaan ini, dua isoform berbagi 65% homologi
dalam urutan asam amino mereka, dengan GAD65 mengandung 585 asam amino. Variasi
urutan utama terjadi di wilayah N-terminal, yang juga muncul untuk memperhitungkan distribusi
intraseluler mereka. Di pankreas, GAD65 sebagian besar terdeteksi dalam vesikel sinaptik-
seperti (SNLVs) sementara GAD67 menunjukkan lokalisasi sitosol dalam sel-sel beta.
Menariknya, kedua pelokalan ini terpisah dari butiran sekresi insulin padat-inti besar dan
autoantigen sel islet T1D lainnya. Jalur sintetis mereka dalam jaringan syaraf dan sel β
menunjukkan kesamaan; baik GAD65 dan GAD67 awalnya disintesis dalam sitosol daripada
ER dan protein GAD menunjukkan regulasi translasi yang berbeda dari proinsulin dan
autoantigen granul. Kondisi hiperglikemik diabetes, paparan jangka menengah sampai jangka
panjang, dapat secara transkripsi meningkatkan sintesis GAD65 secara khusus di atas tingkat
keseluruhan sintesis protein dalam sel. Namun, masih ada area yang membutuhkan penjelasan
dalam hal efek fisiologis GAD65.
5
2.2. Antigenitas GAD
Pada autoimunitas T1D, hanya GAD65 yang antigenik meskipun ekspresi GAD67 yang
lebih tinggi dalam sel islet beta. Perbedaan antigenisitas dari isoform GAD patut dicermati,
terutama mengingat potensi GAD 65 untuk digunakan dalam imunoterapi. Kedua isoform
memiliki aktivitas yang serupa dalam mengkatalisasi sintesa GABA tetapi menunjukkan
perbedaan yang jelas dalam bagian-bagian rangkaian aminoacid mereka dan dalam konformasi
tersier yang dideduksi. GAD65 diasumsikan lebih fleksibel C-terminal, yang merupakan fitur
konsekuensial potensial karena daerah mobilitas unik dalam molekul GAD65 bertepatan
dengan wilayah yang menunjukkan epitop antigenik. Namun ini, tidak berarti bahwa N terminus
dari molekul tidak relevan. Daerah terminal N adalah situs palmitoylation di GAD65, yang
merupakan fitur yang tidak ditemukan dalam antigen islet T1D lainnya dan yang pada
gilirannya, muncul untuk menentukan lokalisasi subselular dari isoform GAD ini, seperti pada
laporan Solimena et al. menunjukkan bahwa substitusi dari 29 asam amino pertama GAD67
dengan 27 residu asam amino pertama dari GAD65 mengarahkan kembali isoform normalnya
sitosol 67 kDa ke Golgi, yang merupakan lokalisasi GAD65 dengan demikian menunjukkan
bahwa 27 asam amino pertama GAD65 mengandung sinyal lokalisasi intraseluler. Penelitian
lain juga menunjukkan bahwa modifikasi pasca translasi molekul di area ini sangat relevan
dengan fungsinya. GAD65 palmitoylated pada dua residu cysteine di wilayah N-terminal dan
fitur yang menentukan orientasi subselular dari isoform GAD. Sementara GAD67 tetap di
sitosol, palmitoylated GAD65 dimasukkan ke dalam membran SNLV, yang menghasilkan
orientasi ke luar dari GAD65 terkait SNLV menghadap sitosol. Dalam posisi inilah GAD65
membentuk kompleks protein kecil yang mengandung transporter GABA vesikular (VGAT).
Berarti, ini memungkinkan produksi lokal GABA oleh GAD65 dan transportasi GABA yang cepat
oleh VGAT ke dalam kompartemen penyimpanan SNLV dalam sel beta.
Penelitian lain yang relevan telah mendalilkan bahwa domain NH2-terminal GAD65
(terutama dinyatakan dalam sel pankreas) melibatkan modifikasi dua langkah, yang mengarah
ke penahan membran yang melibatkan pasca-translasi hidroksilamin palmitoylation. GAD65
dapat dilepaskan dari membran melalui aktivitas enzim. Modifikasi hidrofobik dan penahan
membran dan orientasi GAD65 ke mikrofilter mungkin signifikan untuk perannya sebagai islet
autoantigen.
Perlu dicatat bahwa sel-sel endotel vaskular manusia (Ecs) dapat memproses dan
menyajikan epitop GAD65 yang relevan dengan imun untuk sel T autoreaktif. Transmigrasi in
vitro oleh sel T autoreaktif di seluruh monolayer EC dirangsang oleh penyajian kompleks
peptida / HLA kognitif pada permukaan EC dan juga LFA-1 (limfosit terkait fungsi antigen 1).
6
Karena itu, adalah mungkin bahwa presentasi GAD65, oleh islet endotelium in vivo dapat
mendorong transmigrasi sel-sel T-autoantigen yang beredar dalam kelenjar getah bening
regional terhadap epitop GAD 65 yang bersangkutan.
Ada juga penelitian yang didokumentasikan dengan baik yang menunjukkan bahwa
autoimunitas humoral awal pada T1D diarahkan terhadap epitop terutama di wilayah tengah
molekul dan tetapi juga termasuk C-terminus. Selain itu, studi kristalisasi pemikiran baru-baru
ini dibantu oleh tes antibodi monoklonal penentu antigenik [30] telah menunjukkan bahwa lebih
fleksibel daerah C-terminal GAD65 menunjukkan pengelompokan autoantibodi dan penentu
antigenik sel T.
Selain itu, penelitian ini menunjukkan bahwa ada jarak yang dekat dengan epitop B-dan
T-sel terkait dalam molekul GAD65, dengan implikasi penting bahwa kompleks antigen-antibodi
dapat berkontribusi pada reaktivitas T-sel yang diinduksi GAD65. Sementara pentingnya
wilayah tengah dan C-terminus sebagai situs utama epitop imunoreaktif telah menjadi mapan.
Pelokalan epitop immunoreactive sering tidak stabil dari waktu ke waktu dan dapat menyebar
kemudian ke epitop di daerah N-terminal GAD65 [31,32], meskipun tidak semua penelitian telah
membuktikan waktu terkait epitop intramolekular yang menyebar [33,34]. Sifat dinamis dari
autoimunitas humidifier GAD65 pada T1D kemungkinan akan terus tumbuh sebagai bidang
penelitian untuk mengembangkan tes diagnostik dan pendekatan imunoterapi yang lebih tepat
dan efektif.

2.3 Perjalan Diabetes

Indikasi sebelumnya dari relevansi GAD sebagai biomarker penting untuk diabetes tipe
1 (T1D) muncul dari studi immunoprecipitation yang melibatkan inkubasi pada tikus dengan
radiolabeled methionine, diikuti oleh paparan membran terlarut ke serum dari pasien T1D yang
baru didiagnosis atau kontrol. Hasil dari percobaan ini menunjukkan bahwa serum diabetes
memicu ligan dengan berat molekul 64 kDa. Selain itu, sebagai indikasi kritis potensi GAD
sebagai prediktor risiko untuk T1D, imunoreaktivitas terhadap antigen 64 kDa diamati baik pada
sekitar 80% pasien T1D onset baru dan juga pada subjek pra-diabetes. Sifat dari antigen 64
kDa kemudian dijelaskan oleh karya Solimena et al, menunjukkan autoantibodi ke neuron
GABA-ergik dan sel beta pankreas. Temuan ini memfasilitasi identifikasi GAD sebagai
autoantigen 64kDa di T1D oleh Baekkeskov et al. Penelitian selanjutnya pada GAD65 humoral
autoimunitas pada diabetes telah menyebabkan pengembangan tes menggunakan retikulosit
ditranskripsi / diterjemahkan GAD65 cDNA untuk menggabungkan radiolabeled methionine,
yang diikuti oleh paparan sera, dan imunopresipitasi berikutnya dari antigen berlabel, untuk
7
menentukan apakah sera mengandung anti-GAD65 autoantibodi spesifik. Ini adalah prosedur
standar yang digunakan di seluruh dunia saat ini. Kemampuan untuk menilai autoimunitas anti-
GAD65 humoral dan kesederhanaan relatif dari pengujian, telah menetapkan GAD65 sebagai
titik akhir diagnostik utama untuk menilai autoimunitas T1D terkait dan risiko T1D seperti di usia
yang berbeda, populasi, dalam kelompok etnis yang beragam, dalam karakterisasi subpopulasi
baru diabetes dan dalam pengembangan potensi imunoterapi untuk mencegah atau mengobati
T1D.

2.4. Relevansi klinis untuk mendiagnosis DM tipe 1

Autoantibodi terhadap GAD adalah prediktor kuat dari risiko dan perkembangan untuk
diabetes autoimun. Gabungan GAD65 positif dan autoantigen autoantibodi T1D memiliki
aplikasi prediktif yang andal dan akurat. Menariknya, peningkatan intramolekul dalam
determinan antigenik yang dijelaskan untuk GAD pada bagian sebelumnya, juga memiliki
intermolekuler dalam penyebaran protein islet autoantigenik selama perkembangan diabetes
autoimun, dimana jumlah autoantibodi terhadap autoantigens islet yang berbeda umumnya
meningkat secara berurutan. Sementara autoantibodi anti-insulin telah sering dilaporkan di
antara yang pertama muncul di kedua model hewan diabetes tipe 1 dan manusia, dan
tampaknya menjadi autoantibodi tunggal yang lebih relevan dalam prediksi risiko dan
perkembangan untuk klinis diabetes tipe 1, juga benar bahwa anti-GAD autoantibodi sering
ditemukan pada tahap praklinis awal, keberadaan awal ini dan relatif mudahnya pengujian
untuk anti-GAD autoantibodi yang paling sering digunakan untuk menilai risiko atau
pengembangan ke tahap yang membutuhkan insulin. Selain itu, peningkatan penyebaran
antigen islet intermolecular memiliki nilai prediktif yang sangat besar, karena jumlah
autoantibodi terhadap beragam islet autoantigen telah terbukti berkorelasi dengan risiko dan
tingkat perkembangan menjadi diabetes.
Skrining untuk autoantibodi tunggal seperti autoantibodi GAD65 memberikan tanda
peringatan yang bermakna jika hasil menunjukkan positif dan kepositifan tunggal ini merupakan
indikasi bahwa tes autoantibodi islet tambahan diindikasikan secara akurat menilai risiko dan
memprediksi onset T1D. Hasil triple autoantibodi positif terhadap protein islet yang berbeda
menyiratkan risiko terkena diabetes yang berkisar antara 48 hingga 86% selama lima tahun dan
64 hingga 86% selama 10 tahun, sementara model lain telah memperkirakan bahwa risiko
onset T1D, dengan triple autoantibody positif mendekati 100% setelah 5 tahun.
Strategi spesifik untuk menguji islet autoantibodi telah menjadi bagian dari praktik klinis dan
bergantung pada nilai prediktif dan aksesibilitas metodologis relatif dari tes. Namun, selain dari
8
trilogi tes ini sebagai penentu risiko, kebutuhan untuk menggunakan lebih mudah diterapkan
dan lebih mudah untuk memantau tes menyebabkan standarisasi tes T1D autoantibodi dalam
praktik klinis saat ini. Hal ini menghasilkan pendekatan alternatif di mana strategi yang paling
banyak digunakan untuk menyaring populasi berisiko untuk T1DM adalah untuk menguji
autoantibodi terhadap insulin islet antigen, GAD65 dan IA-2. Baru-baru ini, tes antibodi terhadap
transporter seng ZnT8 telah dianggap sebagai bentuk tambahan. Dalam kedua kasus, terbukti
bahwa GAD adalah "common denominator" assay dalam strategi baik untuk beberapa
pengujian autoantibodi untuk memperkirakan risiko dan tingkat perkembangan ke tahap yang
membutuhkan insulin di T1D. Faktanya, penentuan autoantibodi GAD merupakan pemeriksaan
pertama dalam pemeriksaan reaktivitas autoantibodi di T1D, dalam praktek perawatan
kesehatan klinis.
Kebutuhan untuk mengkoordinasikan protokol metodologis telah menghasilkan strategi
standardisasi seperti penerapan standar referensi serum untuk antibodi GAD dan IA-2 oleh
World Health Organization (WHO) dan yang lebih penting, penciptaan pada 2000, Program
Standardisasi Antibodi Diabetes ( DASP ) oleh upaya gabungan dari Immunology of Diabetes
Society (IDS) dan Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC). DASP melibatkan
jaringan atau konsorsium internasional dari 47 laboratorium utama di 18 negara, yang
memberikan dukungan teknis dan pelatihan, uji profisiensi dan mendukung pengembangan
metodologi, metode referensi dan bahan.
Kegiatan DASP juga telah mengarah pada pengakuan saat ini empat autoantigen pulau
utama, yaitu GAD, Insulin, IA-2, dan ZnT8 dalam penilaian laboratorium klinis dari autoimunitas
T1D-terkait humoral, yang sekali lagi menggarisbawahi relevansi berkelanjutan dari tes GAD
sebagai alat dalam estimasi risiko diabetes. Kebutuhan untuk memberikan dasar bagi
perbandingan hasil juga terus berkembang menjadi upaya harmonisasi untuk menghasilkan
protokol terpadu yang dapat mempertimbangkan perbedaan dalam penggunaan standar seperti
standar WHO relatif terhadap penggunaan standar umum yang digunakan oleh National
Institute. diabetes dan laboratorium konsorsium Pencernaan dan Penyakit Ginjal (NIDDK).
Sementara autoantibodi GAD adalah alat lini pertama dalam penilaian risiko T1D dan
gabungan positifitas GAD dan islet autoantibodi lainnya menghasilkan prediktor risiko yang
sangat akurat, penentuan autoantibodi GAD juga memiliki fitur unik dalam aplikasi klinis, karena
usia terkait insiden pada populasi yang rentan. Telah diketahui bahwa autoantibodi islet lain
seperti autoantibodi dan phogrin insulin adalah prediktor risiko T1D yang sangat akurat pada
masa kanak-kanak [46] dan usia deteksi autoantibodi insulin pada khususnya, menunjukkan
hubungan yang erat dengan usia diagnosis T1D pada anak-anak [39]. Sebaliknya, kehadiran
9
autoantibodi terhadap GAD65 tampaknya terkait dengan usia dewasa dan juga telah dilaporkan
bahwa titer antibodi GAD65 yang tinggi menunjukkan korelasi dengan komplikasi diabetes
jangka panjang seperti retinopati, 15 tahun setelah onset T1D.

2.5. Aplikasi terapi

Pemeliharaan produksi self-antigen oleh timus dan sel imun yang sama khusus adalah
faktor utama dalam pemeliharaan toleransi kekebalan terhadap antigen sendiri. Pemberian
GAD65 kepada tikus diabetes yang tidak obesitas (NOD) dapat mencegah hilangnya sel beta
pankreas secara autoimun. Sebagai hasilnya, penelitian klinis telah dilakukan untuk menilai
apakah pemberian GAD65, sebagai "vaksin tolerogenik" pada pasien T1D yang baru
didiagnosis dapat mencegah atau memperbaiki hilangnya sel beta fungsional. Ketertarikan ini
pada gilirannya mengarah pada pelaksanaan uji klinis Tahap I dan II di mana pasien T1D onset
akut diberikan GAD65 subkutan diformulasikan dengan aluminium hidroksida (GAD-tawas).
Dalam studi klinis Tahap I dan Tahap II, hasilnya menunjukkan efek yang menjanjikan dari
vaksin "GAD-tawas", dalam pencegahan penurunan sekresi insulin tanpa efek samping. Selain
itu, spesifisitas GAD dari respon dibuktikan oleh titik akhir yang menunjukkan bahwa ada GAD
yang menginduksi autoimunitas humoral dan seluler. Selanjutnya, uji klinis Tahap III dilakukan
untuk menilai lebih lanjut efektivitas dan respon dosis dari protokol pengobatan GAD-tawas
dalam melestarikan fungsi sel beta dan hasilnya baru-baru ini dipublikasikan. Sayangnya,
analisis titik akhir yang berkaitan dengan sekresi insulin dan pelestarian fungsi sel beta, tidak
membuktikan temuan positif sebelumnya dan mengarah pada kesimpulan bahwa
penerjemahan pendekatan yang berhasil digunakan pada model hewan menghadirkan
tantangan dalam memperoleh efektivitas yang sama pada pasien manusia untuk aplikasi dalam
praktek klinis.

2.6 Glutamic Acid Decarboxylase 65

Glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65) adalah autoantigen potensial lain ditujukan
untuk terapi T1D. Data dari mencit NOD menunjukkan bahwa vaksinasi GAD65 dapat
mencegah terjadinya T1D. Pemberian GAD65 (Diamyd, 20 µg) dalam suatu studi kecil pada
orang dewasa dengan diabetes autoimun laten menunjukkan tidak ada efek samping dan
pemeliharaan fungsi sel-β endogen versus plasebo. Ini adalah studi intervensi. Suatu uji fase II
yang melibatkan 70 anak (10-18 tahun) dengan T1D, menunjukkan preservasi sel-β tanpa
adanya efek samping yang berhubungan dengan terapi. Akan tetapi, suatu studi fase III pada
334 subyek (berusia 10-20 tahun, terdiagnosis dalam waktu 3 bulan terakhir) dengan terapi
10
GAD-alum versus plasebo tidak dapat menunjukkan preservasi sel-β, didasarkan pada kadar C-
peptide dari awal hingga 15 bulan kemudian. Proporsi efek samping ringan maupun berat sama
baik pada kelompok terapi maupun kelompok plasebo. Belum ada studi prevensi yang
dilakukan.
Secara klinis, diabetes tipe 1 (DM 1) mungkin tampak seperti diabetes tipe 2 dan kedua
hal tersebut seringkali sulit untuk dibedakan. Hanya pemeriksaan petanda autoimun kerusakan
sel β yang dapat membedakan kedua keadaan klinis tersebut. Karena harganya yang amat
mahal ( $150/pemeriksaan), pemeriksaan anti-GAD65-abs tidak dapat dilakukan secara rutin
di sebagian besar atau bahkan di semua laboratorium di Indonesia. Oleh sebab itu, produksi
reagen anti GAD65-Abs di Indonesia mungkin dapat mengurangi biaya dan meningkatkan
kualitas pelayanan diabetes di Indonesia. Kami membuat reagen untuk mendeteksi anti-
GAD65- Abs dengan memanfaatkan otak sapi sebagai sumber enzim dalam 3 tahap. Tahap 1,
mengisolasi dan memurnikan enzim GAD65 dari jaringan otak sapi, mengenali sifat-sifat fisika
dan kimiawi, dan menggunakannya sebagai antigen primer untuk menstimulasi pembentukan
anti-GAD65 di tikus Wistar. Tahap 2, memurnikan dan menggunakan anti-GAD65 hasil
pemurnian sebagai antibodi sekunder untuk menginduksi pembentukan anti-antibodi-GAD65
pada tikus Wistar dan kelinci. Tahap 3, memberi label fosfatase alkali dan peroksidase pada
anti-antibodi-GAD65 dan menggunakannya untuk mengenali anti-GAD65-Abs diabetes tipe 1
yang sebelumnya telah diidentifikasi dengan menggunakan “kit” komersial.

Diabetes tipe 1 dapat muncul sebagai diabetes tipe 2 dan secara klinis tidak mudah
dibedakan. Prevalensi diabetes tipe 1 non-obesitas di Malang adalah 22%, sementara
penelitian lain menemukan 16%-47%. Untuk membedakan kedua kondidi tersebut satu-satunya
cara yang mungkin adalah mengidentifikasi keberadaan marker autoimun terhadap kerusakan
sel. Marker tersebut adalah Islet Cell Autoantibodies (ICAs), Insulin Autoantibodies (IAAs), anti-
glutamic decarboxylase-65 auto-antibodies (anti-GAD65Abs), dan anti-tyrosine kinase auto-
antibodies (IA-2 and IA-2). Marker autoimun tersebut juga dapat digunakan untuk mendeteksi
individu dengan risiko tinggi DM tipe 1 dan untuk tindakan pencegahan primer. Anti-GAD65Abs
adalah marker autoimun penghancuran sel with dengan sensitivitas dan spesifisitas tertinggi.
Lebih jauh lagi, diketahui bahwa anti-GAD65Abs dapat dideteksi hingga 10 tahun sebelum
onset muncul (fase pra-penyakit) dan tetap positif dalam jangka waktu yang lama. Identifikasi
Abs anti GAD65 pada penderita diabetes onset dewasa dapat digunakan sebagai bukti kuat
untuk memulai terapi insulin lebih awal.

11
 BAB III

DISKUSI

Pada usia dewasa, pasien diabetes tipe 1 tidak selalu datang dengan gejala klasik akut
yaitu hipoglikemia berat, ketosis sopntan dan koma. Tidak jarang manifestasi pertama diabetes
tipe 1 mirip dengan diabetes tipe 2, yang pertama kali muncul sebagai gangguan metabolisme
yang stabil dan ringan, dan perlahan-lahan menunjukkan gejala defisiensi insulin absolut. Satu-
satunya cara untuk membedakan antara diabetes tipe 2 dan diabetes tipe 1 yang berjalan
lambat hanya bisa mengidentifikasi penanda auto-antibodi sel pada pasien serum.

3.1 Autoimmune markers of cells damage

Marker kerusakan sel melalui mekanisme autoimun adalah islet cell auto-antibodies (ICAs),
insulin auto-antibodies (IAAs), anti glutamic acid decarboxylase-65 auto-antibodies (anti-
GAD65-Abs), anti tyrosine kinase auto-antibodies (IA-2 and IA- 2). Ditemukan satu atau lebih
marker autoimun ditemukan pada 80-90% pasien DM tipe 1 baru. Anti-GAD65- Abs adalah
penanda autoimun paling sensitif dan spesifik. Selanjutnya diketahui juga bahwa pada DM tipe
1, anti-GAD65Abs dapat dideteksi jauh sebelum (hingga 10 tahun) penyakit ini secara klinis
bermanifestasi, sehingga memberi kesempatan pada tindakan pencegahan primer untuk
mencegah manifestasi penyakit.

Kemampuan untuk mendeteksi keberadaan penanda autoimun juga dapat diterapkan

sebagai dasar yang kuat untuk memulai terapi insulin pada diabetes dewasa yang mulai
menunjukkan tanda-tanda klinis dekompensasi metabolik meskipun terapi diet dan obat oral
hipoglikemik telah diberikan.

Namun, pemeriksaan laboratorium untuk mendeteksi penanda auto-imun tidak secara

rutin dilakukan di sebagian besar laboratorium di Indonesia dan jika dilakukan, biayanya sangat
mahal. Hal ini diyakini bahwa terapi insulin dini pada DM tipe 1 autoimun dengan manifestasi
lambat dikatakan memiliki efek yang baik, yang memperlambat tingkat kerusakan sel
pankreas.

12
 Enzim glutamic acid decarboxylase (GAD) tergolong kelompok enzim liase dan aktif
dalam membagi ikatan C-C, C-O, C-N dan eliminasi gugus karboksil. Menurut Tinamaiya, 12
GAD adalah katalis dalam pembentukan asam but-amino butiric (GABA). Enzim ini dapat
diisolasi dari tumbuhan, mikroorganisme, jaringan otak mamalia, dan sel Langerhans di
pankreas.

3.2 Anti-GAD65Abs (Anti-GAD65-Autoantibodies)

Baekkeskov et al pada tahun 1982 melaporkan keberhasilan dalam identifikasi

komponen sel pulau yang dikenali oleh antibodi pada pasien IDDM, dengan cara
immunoprecipitation untuk mendeteksi antibodi yang mengikat protein sel pulau kecil. Protein
utama yang secara khusus diakui oleh antibodi pasien diabetes kemudian dinamakan sebagai
64K-antigen.

Dalam diagnosis, sekitar 80% pasien DM tipe 1 memiliki antibodi yang dapat mengenali
antigen 64kD. Antibodi juga merupakan penanda yang sangat khusus untuk memprediksi onset
DM tipe 1 di masa depan. Setelah itu, 64 - antigen adalah enzim, yaitu asam glutamat
dekarboksilase (GAD). Penemuan ini tidak langsung pada pasien DM, tetapi pada Stiff-man
Syndrome (SMS). SMS ditandai dengan kekakuan progresif otot yang diikuti oleh kejang yang
menyakitkan karena gangguan pada sistem penghambatan neuronal yang bekerja melalui
GABA (asam amino-amino). Antibodi GAD dapat dideteksi pada 60% pasien SMS. Lebih lanjut
diketahui bahwa SMS adalah penyakit autoimun, dan GAD adalah antigen utama. Semua
pasien SMS yang memiliki antibodi GAD juga memiliki ICA, dan 30% pasien tersebut juga
menderita IDDM. Penelitian lebih lanjut membuktikan bahwa 64K-antigen setara dengan pulau
kecil GAD.

Sekarang sudah diketahui bahwa GAD diekspresikan dalam berbagai jenis isoform. Dua
isoform utama adalah 65 dan 67 kDa (GAD-65 dan GAD-67), yang sudah dikloning dan
diurutkan, hasilnya menunjukkan bahwa keduanya adalah produk dari 2 gen yang berbeda.
Pada manusia, gen GAD-65 terletak pada kromosom ke-10, dan GAD-67 pada kromosom ke-2.
Kedua isoform memiliki urutan yang berbeda dalam 100 asam amino pertama dari N-terminus,
tetapi memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dalam sisa asam amino.
Persimpangan antara kedua daerah (100 asam amino pertama dan sisa asam amino)
merupakan target utama berbagai jenis enzim proteolitik (proteolitik hot spot). Urutan asam
amino menunjukkan sedikit homolog dengan molekul protein lainnya. Bahkan itu, baik GAD-65
atau GAD-67, di beberapa tempat (asam amino 250-273 untuk GAD-65 dan 253-281 untuk
13
GAD-67) menunjukkan kesamaan dengan protein P2-coxackievirus B4. Beberapa penelitian
menunjukkan adanya hubungan antara infeksi coxackievirus B4 dengan munculnya IDDM.
Peniruan molekul protein B4 coxackievirus P2-C dan GAD mungkin bisa terkait dalam induksi
respon autoimun terhadap GAD.
GAD-67 adalah molekul hidrofilik dan larut, sedangkan GAD-65 dalam bentuknya yang
matang adalah molekul hidrofobik, yang berhubungan dengan membran; Pada sel neuronal
enzim ini berhubungan dengan sinaps vesikula dan di sel pankreas berhubungan dengan
vesikula sinaptik '. Perbedaan urutan dari 100 asam amino pertama antara GAD-65 dan GAD-
67 dapat bertanggung jawab terhadap kompartmentialisasi dari dua isoform.
Meskipun tingkat urutan asam amino homolog antara GAD-65 dan GAD-67 tinggi, kemampuan
antibodi auto untuk mengikat kedua isoform tersebut sangat berbeda. Pada manusia GAD-65
adalah isoform utama, sementara GAD-67 hanya dikenali oleh antibodi pada 20% pasien IDDM.
Selanjutnya diketahui bahwa porsi yang memiliki cukup banyak ikatan GAD-67 adalah karena
reaktivitas silang parsial dengan GAD-65. Meskipun penelitian besar tentang prevalensi GAD
pada populasi umum belum dilakukan, tetapi penelitian lain menunjukkan bahwa pada
umumnya populasi prevalensinya rendah (<5%).

3.3 Enzim kasar GAD, enzim GAD murni

Hasil ini menunjukkan bahwa jaringan otak sapi dapat digunakan sebagai sumber alternatif
enzim dekarboksil asam glutamat. Elektroforesis dengan SDS-PAGE untuk mengukur massa
molekul (MM) protein enzim kasar dan juga enzim dimurnikan bertahap dengan amonium sulfat
dan gel permeasi kolom (Sephadex G-75) secara konsisten menunjukkan 65 kDa pita protein
(Gambar 1).

14
Anti-GAD65Abs

Enzim kasar dan juga enzim GAD yang dimurnikan, sebagai antigen primer dapat digunakan
untuk menginduksi sintesis anti-GAD65 pada tikus Wistar. Imunisasi untuk menginduksi sintesis
anti- GAD65 dilakukan pada tikus Wistar dengan injeksi 1500 L (enzim 250 GAD65 + GAD65
+ CFA (Ajuvan Lengkap Freund), dan diulang setelah 2 minggu dengan enzim 250 g GAD65
+ IFA (Incomplete Freund's Ajuvant) dengan rasio 1: 1. Hasil analisis Western Blotting
menunjukkan bahwa induced anti-GAD65 cukup sensitif dalam mengenali peptida enzim GAD,
termasuk peptida dengan 65 kDa yang dikenal sebagai penanda kekebalan diabetes tipe 1.
Anti-GAD disintesis oleh Wistar tikus juga dikenali oleh antibodi pada pasien serum yang
diketahui memiliki anti-GAD65Abs yang telah terdeteksi dengan menggunakan metode ELISA
dan pereaksi komersial (DNA rekombinan GAD65) dan tikus Wistar diabetes sterptozotokin. Hal
ini menunjukkan kesamaan respon antara anti-GAD yang disintesis oleh tikus normal diinduksi
dengan enzim GAD dari isolasi, dengan peptida anti-GAD dari pasien IDDM {dengan anti-
GAD65Abs (+) . Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa enzim GAD diisolasi dari otak sapi
dan tr Antibodi yang iggered memiliki reaksi silang yang sama.
Hasil dari menjalankan SDS-PAGE anti-GAD murni yang diisolasi dari serum tikus 1 bulan dan
2 bulan setelah injeksi menunjukkan pita protein. Pita Anti-GAD65 dipisahkan oleh
electroelusion dan setelah dijalankan dengan SDS-PAGE hasil band ditunjukkan pada Gambar
2.

15
3.4 Biosynthesis of anti-anti-GAD65Abs

Untuk menghasilkan anti-anti-GAD65Abs, imunisasi kelinci lokal dilakukan dengan

menyuntikkan anti-GAD65 dimurnikan sebagai antigen sekunder. Isolasi anti-anti-GAD65Abs
dilakukan dalam 1 minggu, 2 minggu, 1 bulan, dan 2 bulan setelah injeksi, dan diikuti dengan
pemurnian menggunakan amonium sulfat jenuh (SAS 50%).
Hasil dari menjalankan SDS-PAGE 12% serum kelinci yang telah diimunisasi menunjukkan
adanya band anti-anti-GAD65Abs (dikonfirmasi dengan penanda protein) (Gambar 3). Band
65kDa adalah hasil dari respon kelinci untuk imunisasi dengan anti-GAD. Band 65kDa telah
terbukti tampil konsisten. Hasil dari menjalankan SDS-PAGE anti-anti-GAD65 dengan durasi
induksi yang berbeda menunjukkan bahwa pita protein 65kDa lebih tebal daripada pita protein
lainnya.
Untuk mengetahui analog antara enzim GAD yang diisolasi dari otak sapi dengan anti-
GAD65Abs (dari induksi GAD65) dan anti-anti-GAD65Abs (dari induksi anti-GAD65),
pemeriksaan Western Blotting dilakukan. Hasil pemeriksaan dengan serum pasien IDDM
dengan anti-GAD65Abs (+) memiliki reaksi positif. Serum anti-GAD65Abs positif sebelum
terdeteksi dengan metode ELISA menggunakan kit GAD65 rekombinan manusia yang
diproduksi oleh Boehringer Mannheim; serum positif tersebut memiliki titer anti-GADAbs 1.05-
2.770.
Dari Western Blotting, hanya pada kelompok tikus yang diobati (Gambar 4) muncul
beberapa band yang dicurigai sebagai antibodi 65 kDa. Pola ketebalan pita tergantung pada
waktu induksi dan kualitas material (antigen). Hasil uji Western Blotting terhadap serum pasien
IDDM dengan anti-GAD65Abs (+) menunjukkan bahwa enzim GAD yang diisolasi dengan otak
sapi dapat dikenali oleh autoantibodi-GAD65 penderita diabetes dan juga tikus.

3.5 Anti-anti-GAD65Abs labeling

Pelabelan anti-anti-GAD65Abs dari biosintesis hewan laboratorium digunakan untuk melakukan

tes Dot Blotting pada serum tikus diabetes dan pasien IDDM dengan anti-GAD65Abs (+), juga
dilakukan dalam konsentrasi yang berbeda dari enzim GAD (Gambar 5).

16
 Pelabelan dilakukan dengan alkali fosfatase dan peroksidase. Reaksi positif dari hasil
Dot Blotting menunjukkan keberhasilan pelabelan, karena serum yang terdeteksi berasal dari
serum pasien DM dengan anti-GAD65Abs (+) yang telah diuji oleh ELISA. Hasil pelabelan
menggunakan alkali fosfatase lebih stabil dibanding peroksidase yang cepat pudar. Semakin
tinggi konsentrasi enzim GAD yang digunakan dalam pengujian, semakin tebal warna Dot
Blotting. Dari hasil Dot Blotting, konsentrasi enzim GAD yang digunakan dipilih (2/10 dilusi)
dengan konsentrasi anti GAD65 berbeda. Hasil uji Dot Blotting dengan konsentrasi anti-
GAD65Abs 2/100 sudah menunjukkan reaksi positif.
17
 BAB IV
Simpulan

 Enzim GAD, baik yang mentah maupun yang dimurnikan dapat menginduksi biosintesis
anti-GAD65Abs pada tikus Wistar, dan isolat anti-GAD65 yang diisolasi dan dimurnikan
dari tikus Wistar dapat menginduksi biosintesis anti-anti-GAD65Abs pada kelinci lokal.
 Dengan menggunakan metode Western Blotting dapat dibuktikan bahwa GAD dapat
dikenali oleh anti-GAD pada tikus Wistar, serum pasien IDDM dengan anti-GAD65Abs
(+). Dengan menggunakan metode Dot Blotting, Anti-GAD65Abs yang telah diberi label
dengan alkali phosphatase memiliki reaksi positif dengan serum pasien IDDM dengan
anti-GAD65Abs (+).
 Fenomena ini menunjukkan bahwa enzim GAD yang diisolasi dari jaringan otak sapi
dapat dikembangkan menjadi reagen untuk mendeteksi anti-GAD65Abs di IDDM.
 Lebih banyak jumlah sampel serum IDDM dengan anti-GAD65Abs (+) diperlukan untuk
menentukan cut-off konsentrasi reagen dari produksi di atas
 Meskipun ekspresi GAD65 tidak eksklusif untuk sel beta pankreas, relevansi GAD65
sebagai biomarker spesifik dalam prediksi risiko diabetes, serta jalan potensial untuk
terapi immunoregulatory terus berkembang sebagai area penyelidikan. Aplikasi tes
mendeteksi autoantibodi terhadap GAD65 terus menjadi layar utama untuk mendeteksi
diabetes autoimun. Pengetahuan yang diperoleh dari pemahaman kita tentang fitur
struktural dari molekul GAD65 dan implikasinya dalam pengembangan epitop
autoantigenic immunoreactive, telah memberikan alat yang berguna untuk lebih
mengidentifikasi risiko dan prediksi ke tahap yang membutuhkan insulin pada populasi
rentan, tidak hanya di "klasik" Diabetes tipe 1 tetapi juga dalam bentuk penyakit yang
baru-baru ini dikarakterkan, seperti kasus LADA. Bidang-bidang penelitian ini
kemungkinan akan tetap menjadi fokus penelitian besar yang berlanjut untuk masa
mendatang.
 Penggunaan GAD65 sebagai terapi imunomodulator juga perlu didiskusikan. Bukti saat
ini menjelaskan efek yang menjanjikan pada pelestarian fungsi sel beta dengan
penggunaan GAD65 sebagai vaksin "tolerogenic", setidaknya dalam studi Tahap I dan
II. Sementara uji klinis Fase III yang besar dan baru-baru ini tidak membuktikan temuan
sebelumnya dan menjanjikan, faktanya tetap ada masih ada pertanyaan dan
kemungkinan cara alternatif terapi dengan GAD65. Ini termasuk presentasi yang
berbeda dari kompleks molekul GAD65 serta frekuensi alternatif, dosis dan rute
18
pemberian "vaksin" GAD65. Pertimbangan-pertimbangan ini perlu diteliti dengan cermat
dan layak untuk diteliti lebih lanjut. Bahkan jika uji coba Tahap III yang lebih besar
memberikan hasil yang mengecewakan, keseluruhan data tubuh tidak berarti
mengecilkan dan layak upaya lebih lanjut. Penelitian terkait diabetes di masa depan
pada GAD65 kemungkinan akan terus memperluas dan memperdalam pengetahuan
dan aplikasi klinis potensial dari molekul serbaguna unik ini.

19
 Daftar Pustaka

Soeatmadji, Aulanni’am, Fatah, Sumitro. Detection of GAD65 autoantibodies of type-1 diabetes

using anti-GAD65-abs reagent produced from bovin brain tissue. Detection of GAD65 auto-
antibodies. Med J Indones. Vol 14. No 4, 2005.
Roberto Towns and Massimo Pietropaolo. GAD65 autoantibodies and its role as biomarker of
type 1 diabetes and Latent Autoimmune Diabetes in Adults (LADA). Drugs Future. 2011, Nov;
3211; 847.
Soeatmadji, Aulanni’am, Fatah, Sumitro. Konfismasi Spesifitas GAD65 terhadap anti-GAD65
pada tikus DM dan pasien DM tipe 1. Lab of Molecular Biology. Brawijaya university. Berk.
Panel. Hayati: 11 (125-128), 2006
Aulanni’am. Monoklonal antibodi autoantibodi GAD65 upaya perkaitan suatu kit deteksi dini
pasien DM tipe 1. Universitas Brawijaya. 2009
Soeatmadji, Aulanni’am, Sumitro. Monoclonal antibodies to human autoantibodies GAD65 for
early detection type 1 diabetes patients via hybrioma technology. 2008
Nokoff & Rewers. Pathogenesis of type 1: lessons from natural history studies of high-risk

individuals. 1Department of Pediatrics, and 2Barbara Davis Center for Childhood Diabetes,
University of Colorado School of Medicine Ann.N.Y.Acad.2013

Craig, et al. Definition, epidemiology and classification of diabetes in children and adolescents.
Pediatric Diabetes 2009: 10

20