LAPORAN​ ​PRAKTIKUM BIOKIMIA FARMASI (FAF 1773)

PERCOBAAN 2

PEMISAHAN PROTEIN DENGAN METODE SDS-PAGE

Dikerjakan oleh:

Kelas/Golongan/Kelompok: ​C/IV/3

NIM Nama mahasiswa Kontribusi TTD

20/461332/FA/12903 Tsania Inas Cara kerja,

Salsabila pembahasan,
prinsip metode
purifikasi, dan
perkiraan berat
molekul

Cara kerja,
20/461333/FA/12904 Victorius Kristiono pembahasan,
konsep pemisahan
protein dengan
SDS-PAGE dan
kesimpulan
20/461334/FA/12905 Waly Prakasa Metode purifikasi
Selalau terbaik, perkiraan
berat molekul dan
kesimpulan

20/461335/FA/12906 Wanda Septia Penentuan reagen,

Wahyuni pemisahan pita
protein pada
SDS-PAGE
sebelum dan
sesudah ditambah
reagen ,
kesimpulan

20/461336/FA/12907 Warda Fatin Nabila Cara kerja, kurva

baku, perhitungan
BM protein A, dan
kesimpulan

Tanggal pengumpulan : Selasa, 23 Februari 2021

Dosen pembimbing : Dr.apt. Tatang Irianti, M.Sc.

Asisten : Jesica Mei Sabani

LABORATORIUM BIOKIMIA FARMASI

DEPARTEMEN KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI UGM

2021
1. TUJUAN

Mahasiswa dapat melakukan pemisahan dan menentukan bobot molekul protein dengan
metode SDS-PAGE.

2. CARA KERJA

Dibersihkan kaca untuk pencetak gel dengan etanol, dikeringkan kemudian dipasang pada
alatnya

Dibuat gel poliakrilamid 10%.

Dibuat campuran gel pemisah

Dituang segera campuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng kaca. Disisakan
kira-kira 2,5 cm dari tepi atas lempeng kaca untuk gel penumpuk.

Diteteskan isobutanol untuk menyingkirkan udara pada bagian atas gel dan agar batas antar
gel dapat terbentuk dengan baik.

Dibiarkan gel pemisah berpolimerisasi.

Dibersihkan isobutanol setelah gel pemisah berpolimerisasi

↓
 Dibuat gel penumpuk

Dituangkan campuran gel penumpuk di atas gel pemisah. Disisipkan plastik (sisir)
pembentuk sumuran sampel.

Dibiarkan hingga gel penumpuk berpolimerisasi. Setelah gel penumpuk berpolimerisasi,

diangkat plastik pembentuk sumur dan dilepas klem serta spacer.

Diletakkan klem lempeng kaca dan gel secara vertikal pada alat elektroforesis. Diisi tempat
dapar dengan elektroda. Disingkirkan gelembung udara pada bagian bawah gel.

Dicampur larutkan sampel/ marker protein dengan dapar sampel. Setelah itu, dipanaskan
larutan tersebut pada air mendidih (95 - 100ºC) selama 5 menit.

Diberi nomor pada sumuran, kemudian dimasukkan sampel dan marker protein ke dalam
sumur. Dicatat nomor sumuran dan nama sampel yang dimasukkan.

Dihubungkan alat elektroforesis dengan power supply. Dijalankan elektroforesis dengan

voltase 200 volt/cm. Dinaikkan voltase menjadi 250 volt/cm setelah pewarna masuk ke gel
pemisah,.

Dibuka klem setelah elektroforesis selesai. Diangkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca,
kemudian dipisahkan lempeng kaca dari gel. Dipotong gel pada batas antara gel penumpuk
dan gel pemisah. Ditandai salah satu ujung gel (dipotong sedikit di salah satu ujung atas
gel).
 ↓

Diangkat gel dan direndam dalam larutan pewarna (​coomassie blue​) selama 30 - 60 menit.
Kemudian gel dipindahkan ke dalam larutan pencuci (asam asetat metanol). Jika perlu,
ganti larutan pencuci beberapa kali sehingga warna latar belakang memudar dan pita-pita
protein jelas terlihat.

Dibandingkan mobilitas protein-protein sampel dengan protein marker untuk menentukan

berat molekulnya.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Cara kerja yang dilakukan, pertama adalah membersihkan kaca untuk pencetak gel
dengan etanol, keringkan kemudian pasang pada PAGE insert dan caster. Pastikan cetakan
gel tidak bocor dengan menambahkan air pada cetakan. Kemudian buat gel poliakrilamid
10% dengan mencampur larutan dengan komposisi dan urutan sesuai tabel komposisi
SDS-PAGE. TEMED dan APS ditambahkan paling akhir. APS sebaiknya dibuat sebelum
digunakan.

Tabel Komposisi SDS-PAGE

Tuang segera campuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng kaca. Sisakan
kira-kira 2,5 cm dari tepi atas lempeng kaca untuk gel penumpuk. Gel pemisah dicetak
terlebih dahulu, setelah gel tersebut mengeras, baru gel penumpuk dicetak diatas gel
pemisah. Teteskan isobutanol untuk menyingkirkan udara pada bagian atas gel dan agar batas
antargel dapat terbentuk dengan baik. Biarkan gel pemisah berpolimerisasi. Setelah gel
pemisah berpolimerisasi bersihkan sisa isobutanol. Buat gel penumpuk seperti pada tabel dan
 tuangkan larutan diatas gel pemisah. Sisipkan plastik (sisir) pembentuk sumuran sampel.
Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepas plastik pembentuk sumuran dan lepaskan PAGE
insert dari caster. Letakkan PAGE insert berisi lempeng kaca dan gel secara vertikal pada alat
elektroforesis. Isi tangki tempat buffer dengan SDS running buffer hingga penuh dan
singkirkan gelembung udara pada bagian bawah gel.

Selanjutnya, disiapkan sampel protein. Lalu, diambil 4 bagian sampel protein uji
(misalnya 240 μL ). Ditambahkan 1 bagian sampel buffer (misalnya 60 μL ), kemudian
dicampur homogen. Lalu dipanaskan pada air mendidih pada suhu 95 ° -100 ° C selama 5
menit. Kemudian, dimasukkan 20 μL sampel yang sudah diberi sampel buffer ke dalam tiap
sumuran. Setelah itu, diingat dan dicatat nomor sumuran serta nama sampel yang
dimasukkan ke dalam tiap sumuran. Digunakan protein marker paling tidak satu sumuran
pada setiap gel. Lalu dihubungkan alat elektroforesis dengan ​power supply​. Setelah menyala,
dijalankan elektroforesis dengan voltase 200 volt (arus sekitar 60 mA) selama 60-120 menit
atau sampai telah ​running h​ ingga 80 dan gel pemisah. Dipastikan ​running berjalan secara
baik dan benar dengan mengamati gelembung yang terjadi pada tangki. Indikator lama
tidaknya proses ini adalah jarak protein yang telah bermigrasi ke kutub positif (anoda).
Setelah elektroforesis selesai, dibuka klem lalu diangkat ​spacer p​ ada kedua sisi lempeng
kaca. Kemudian, dipisahkan lempeng kaca dari gel lalu dipotong gel pada batas antara gel
penumpuk dan gel pemisah, lalu ditandai salah satu ujung gel dengan dipotong sedikit di
salah satu ujung atas gel. Setelah itu, disiapkan larutan pewarna yaitu ​coomassie blue.​
Pewarna ini bertujuan untuk mempermudah pengamatan. Gel diangkat dan direndam dalam
larutan pewarna selama 30-60 menit atau sampai pita protein terlihat dengan digoyang
perlahan di atas ​shaker.​ Jika pita protein sudah terlihat, dipindahkan larutan pewarna ke
dalam wadah lalu dilakukan pencucian gel dengan larutan pencuci (​aquades)​ lalu digoyang
perlahan di atas shaker. Jika perlu, diganti larutan pencuci beberapa kali sehingga warna latar
belakang memudar dan pita-pita protein jelas terlihat. Lalu diamati dengan dibandingkan
mobilitas protein-protein sampel dengan protein marker untuk menentukan berat molekulnya.
Hasilnya, dicatat dan dilakukan perhitungan Rf dengan membagi jarak migrasi dan jarak
elusi yang diukur menggunakan penggaris, kemudian dihitung juga BM dengan mengganti
log y.

4. KESIMPULAN

​ erdasarkan praktikum pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE diatas dapat disimpulkan
B
bahwa :

1. Metode SDS-PAGE memisahkan protein berdasarkan ​ukuran molekul protein, dimana

protein yang berukuran lebih besar akan bergerak lebih lambat sedangkan molekul yang
 lebih kecil akan bergerak lebih cepat pada gel ketika elektroforesis. SDS berfungsi untuk

melarutkan molekul hidrofobik dengan muatan negatif yang akan mendenaturasi protein,

sedangkan matriks gel ​ ​poliakrilamid (PAGE) digunakan untuk memisahkan protein.

2. Pada ​Native-​ PAGE protein dipisahkan dalam bentuk ​native/​ aslinya dan pemisahan

protein berdasarkan ukuran, muatan, dan bentuk ​native dari protein. Tidak seperti

native-PAGE, dengan SDS-PAGE kita bisa memisahkan subunit protein. Sementara

untuk ikatan disulfida yang tidak dapat didenaturasi oleh SDS, dapat diputus/denaturasi

dengan penambahan reagen​ ​β-mercaptoethanol ​(​β-ME)

3. Persamaan kurva baku Rf vs Log BM yang didapat ​y = 2,5567-2,0172x ​dan perkiraan BM

protein A sebesar 117,49 KDa

4. Metode pemurnian yang dipakai ada 3, yaitu salting out, ion exchange chromatography,

dan kromatografi afinitas, dengan metode pemurnian kromatografi afinitas terbukti yang

paling baik.

5. Secara kasar, perkiraan Berat Molekul protein hasil SDS-PAGE adalah 43,000 g/mole

5. DAFTAR PUSTAKA

Deustcher, Murray, 1990, ​Guide to Protein Purification​, Farmington : University of

Connecticut Health Center.
Sismindari, dkk, 2017, ​Biokimia Farmasi​, Yogyakarta, UGM press
Yap, C. K., A. Ismail, and S. G. Tan., 2003, ​Concentration of Cu, Pb, Zn in the
Green-Lipped Mussel Verna viridis​, Peninsula Malaysia, Journal Trop.
Agriculture, Vol. 46, pp. 1035-1048.
 Lembar Kerja Praktikum Biokimia

Pemisahan Protein dengan Metode SDS PAGE

1. Konsep pemisahan protein dengan SDS-PAGE

SDS-PAGE memisahkan protein berdasarkan 1​ ​ukuran molekul protein, dimana
protein yang berukuran lebih besar akan bergerak lebih 2​ ​lambat sedangkan molekul
yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat pada gel ketika elektroforesis. SDS
merupakan detergen 3​ ​yang melarutkan molekul hidrofobik ​dengan muatan 4​ ​negatif yang
akan mendenaturasi protein. SDS juga mampu mendenaturasi struktur kuarterner protein
namun SDS tidak dapat mendenaturasi ikatan 5​ ​disulfida protein. Matriks gel 6​
poliakrilamid digunakan untuk memisahkan protein. Marker protein merupakan
protein-protein referensi sebagai kontrol pada eksperimen dimana protein-protein
tersebut sudah 7​ ​diketahui kuantitas dan bobot molekulnya. Ukuran dan kuantitas protein
X / sampel protein dapat diketahui dengan membandingkan jarak 8​ ​yang ditempuh
protein sampel dengan protein marker. Suatu plot log Mr (bobot molekul) vs. migrasi
relatif pada gel SDS PAGE menggambarkan hubungan yang 9​ ​linear. Pita protein hasil
pemisahan dengan SDS-PAGE dapat divisualisasi dengan pengecatan menggunakan
​ ​coomassie blue.
reagen 10

2.

Perhatikan gambar di atas. Pada ​Native​-PAGE protein dipisahkan dalam bentuk

native/​ aslinya dan pemisahan protein berdasarkan ukuran, muatan, dan bentuk ​native dari

protein. Tidak seperti native-PAGE, dengan SDS-PAGE kita bisa memisahkan subunit
 protein. Gambar di kiri menunjukkan suatu protein dengan subunit A, B, C, D. Besarnya

bola menggambarkan ukuran masing-masing sub unit. Ikatan disulfida tidak dapat

didenaturasi oleh SDS, namun dapat diputus/denaturasi dengan penambahan reagen

β-mercaptoethanol ​(​β-ME)

b. ​Tuliskan langsung pada gambar di kanan untuk menunjukkan protein A, B, C, D pada

masing-masing pita protein baik pada hasil SDS-PAGE yang di tengah maupun yang

paling kanan

3. Buatlah kurva baku antara Rf (jarak elusi 70 mm) dan log BM berikut ini dengan terlebih

dahulu melengkapi tabel

No Jarak Rf Jenis Protein BM Log BM

(mm) (KDa)
1 5 0,07 Myosin 250 2,398

2 12 0,17 Phosphorylase 148 2,170

3 20 0,29 BSA 98 1,991

4 26 0,37 Glutamic 64 1,806

dehydrogenase

5 33 0,47 Alcohol 50 1,699

dehydrogenase

6 60 0,86 Aprotinin 6 0,778

7 17 0,24 Protein A

Persamaan kurva baku :

y = a + bx x = Rf

y = 2,5567-2,0172x y = Log BM
 b. Perkirakan BM protein A dengan jarak migrasi (17 mm) (2)

Rf = (jarak migrasi) /(jarak elusi)

Rf = 17/70

Rf = 0,24

Persamaan kurva baku :

y = 2,5567 - 2,0172x x = Rf

y = log BM = 2,5567 - 2,0172x y = log BM

= 2,5567 - 2,0172(0,24)

= 2,072572 ≈ 2,07

BM = 10​2,07 ​= 117,49 KDa

4. Perhatikan gambar di bawah ini. SDS-PAGE dapat diaplikasikan untuk menganalisis

kemurnian protein. Gambar tersebut merupakan gambar hasil SDS-PAGE suatu

sampel protein hasil purifikasi/pemurnian beberapa metode (sampel 3-5).

Kolom 1 adalah ​ladder/​ protein marker

Kolom 2 adalah ekstrak sampel protein (belum dipurifikasi/dimurnikan)

Kolom 6 adalah kontrol protein murni

a. Jelaskan prinsip pemisahan masing-masing metode purifikasi yang digunakan

(kolom 3-5).

1. Salting Out

Pada metode ​salting out​ kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan
ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tinggi kelarutan protein akan
menurun. Molekul air akan lebih tertarik pada ion-ion yang kecil dibandingkan ion yang
besar. Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin banyak yang
menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein sehingga
mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan kemudian mengendap
(Sismindari, dkk, 2017).

2. Ion exchange chromatography

Proses pemurnian berdasarkan dari muatan protein dengan menggunakan resin

yang dimodifikasi dengan gugus kimia bermuatan positif dan negatif (Tan dan Yiap,
2009). Pada titik isoelektrik protein pI nya 0, jika diatas titik isoelektrik protein pI nya
negatif, sedangkan jika di bawah titik isoelektrik protein pI nya positif. Protein yang
berikatan lemah dengan resin akan terelusi dengan buffer yang mengandung garam
berkonsentrasi rendah, sedangkan protein yang berikatan kuat dengan resin akan
membutuhkan konsentrasi garam yang lebih tinggi untuk elusinya (Tan dan Yap, 2009).

Muatan dari fase diam metode ​Ion exchange chromatography

a. Fase diam dari kolom yang bermuatan negatif, maka protein dengan muatan positif
akan binding pada fase diam tersebut

b. Fase diam bermuatan positif, maka protein dengan muatan negatif akan binding
pada fase diam tersebut

c. Protein yang telah binding pada fase diam tersebut dapat dilepaskan menggunakan
NaCl pada konsentrasi tertentu. Dalam hal ini, NaCl akan berkompetisi dengan molekul
yang terikat pada fase diam sehingga protein tersebut lepas

d. Protein yang muatannya paling tinggi akan terlepas terlebih dahulu dan keluar dari
kolom untuk kemudian ditampung (Sismindari, dkk, 2017)

Ion exchange chromatography​ dapat dilakukan ketika kontaminan produk yang

dialirkan melalui kolom dapat terikat dan diadsorpsi oleh matriks, sehingga protein yang
dikehendaki dapat terikat. Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif,
sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan
yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan
kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun, jika muatan molekul tidak sama
dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionic dengan kolom.
Untuk mengelusi ikatan yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan
dengan pH dan kekuatan ionic tertentu (Deutscher, 1990).

3. Kromatografi Afinitas
 Metode kromatografi yang pemisahannya didasarkan pada aktivitas biologinya.
Fase diam mengandung molekul yang dapat berikatan secara spesifik dengan protein
sehingga akan didapatkan protein yang spesifik. Metode ini merupakan metode
pemisahan yang sangat bagus karena akan segera diperoleh protein murni sesuai yang
diinginkan (Sismindari, dkk, 2017)

b.​ ​Berdasarkan gambar hasil SDS-PAGE tersebut, tentukan metode manakah yang
dapat memurnikan protein paling baik (kolom 3-5)? Jelaskan mengapa Anda bisa
menentukan demikian!

Kolom ke-5, yaitu metode Kromatografi Afinitas. Dapat dilihat pada gambar hasil
SDS-PAGE, hasil teknik pemurnian kromatografi afinitas merupakan hasil yang paling
baik diantara tiga teknik.

Alasannya, seperti yang dijelaskan pada poin a, bahwa fase diam dalam metode
kromatografi afinitas mengandung molekul yang secara spesifik berikatan dengan
protein yang ingin dimurnikan, sedangkan protein yang lain akan keluar dari kolom
tersebut.

c. Berdasarkan gambar hasil SDS-PAGE tersebut, perkirakan secara kasar bobot

molekul protein (kolom 6)!

Pada gambar diketahui bobot molekul protein berada pada rentang 31,000-45,000
g/mole. Secara kasar dapat diperkirakan bobot molekul protein sebesar 43,000 g/mole