D.

Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Flavonoid
Ekstraksi & Isolasi

D.Juanda
1
FF UBK 2021
https://ethnopharmacology.a
lliedacademies.com/
Ekstraksi Flavonoid

Metode
?
Pelarut
2 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
Ekstraksi – Fraksinasi Flavonoid

 Harbone, J.B. (1996) : Metoda Fitokimia, terjemahan K.

Padmawinata dan I. Soediro, Penerbit ITB, Bandung
 Markham, K. R. (1988) : Cara Mengidentifikasi Flavonoid,
terjemahan K. Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung.
 Sirait, Midian. (2007) : Penuntun Fitokimia Dalam Farmasi,
Penerbit ITB, Bandung.
 Mabry, Flavonoid

3 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 Antosianin

http://dx.doi.org/10.5772/66881

4
D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
 Anthocyanin-Functionalized Contact Lens Sensors for Ocular pH Monitoring.
ACS Omega ( IF 2.870 ) Pub Date : 2019-12-12 , DOI: 10.1021/acsomega.9b02638

5
D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
 Ekstraksi Flavonoid (Charaux-Paris)
Serbuk Simplisia
Ekstraksi dg EtOH atau MeOH

Ampas Ekstrak
+ Air panas → disaring
https://thenounproject.com/term/separating-funnel/534653/

Endapan Filtrat
ECC (n-heksana)

Fraksi n-heksan Fraksi air

ECC (Eter)

Fraksi Eter Fraksi air

ECC (EtOAc)

Fraksi EtOAC Fraksi air

ECC (BuOH)

Fraksi BuOH Fraksi air6

D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
Pemisahan Flavonoid

 Kromatografi kolom

 Kromatografi lapis tipis (KLT)

 Kromatografi kertas (Kkt)

TLC : https://gfycat.com/brightembellishedherring

7
D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
Kromatografi Kolom

 Adsorben

Silika gel
▪ Isoflavon
▪ Flavanon
▪ Dihidroflavonol
▪ Flavon → Yang mengalami metilasi dan asetilasi
▪ Flavonol → Yang mengalami metilasi dan asetilasi
▪ O- dan C-glikosida dari isoflavon
Silika gel: https://basicmedicalkey.com/high-performance-liquid-chromatography/

8 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 Isoflavon

Deconjugation of soy isoflavone glucuronides needed for estrogenic activity (DOI: 10.1016/j.tiv.2015.01.013)

9 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Kromatografi Kolom

 Eluen / Fase Gerak

▪ N-heksana –EtOAc (6:1)

▪ N-heksana-CHCl3 (1:1)
▪ CHCl3-MeOH (20:0,8)
▪ EtOAc-MeOH (19:1)

10 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Kromatografi Kolom
➢ Selulosa
Untuk semua kelas flavonoid
Untuk Glikosida

 Eluen
▪ EtOAc-MeOH-Air
▪ Asam asetat 2%
▪ Asam asetat 5%
▪ BAW (4:1:5)

11 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Cara membuat BAW ???

https://hydrobuilder.com/

12 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

KLT

Adsorben = Kromatografi kolom

Eluen = Kromatografi kolom

CHCl3-MeOH (15:1)
 N-heksana-EtOAc (3:1)
 CHCl3-EtOAc (1:1)

13 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Kromatografi Kertas

Eluen
➢ Asam asetat 2-60%
➢ BAW (4:1:5)
➢ Forestal (asam asetat-
HCl-Air) 10:3:10
➢ t-Butanol- Asam
asetat-Air (3:1:1)

Gambar PC : biotechniquesden
14 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
Deteksi di Bawah Sinar lampu UV

 Sinar lampu UV λ 366 nm

 Sinar lampu UV λ 254 nm
Spot berwarna gelap (Fase diam silika)

 Diuapi iodin
Muncul sebagai bercak kuning – coklat

 AlCl3 (Metanol)

15 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 Pereaksi semprot
untuk Flavonoid

https://www.kisker-
biotech.com/frontoffice/product?produitId=0D-09-
23

16 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Pereaksi Semprot

 AlCl3
 Sitroborat
 Kompleks difenil-asam borat-etanolamin
(Naturstoffreagenz A)
 Asam sulfanilat yang terdiazotasi
 Vanilin HCl
 NP/PG

Sprayer : https://www.mn-net.com/laboratory-reagent-sprayer-glass-with-rubber-bulb-814101
17 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
AlCl3

 AlCl3 5% dalam Metanol

 Pada kromatogram
 Disemprotkan dikeringkan
 Menunjukan semua 5-hidroksi-flavonoid
 Bercak berfluoresensi kuning
 Pengamatan pada sinar UV 366 nm

18 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Pemantauan Flavonoid

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
UV λ 254 nm UV λ 366 nm AlCl3 5% Tampak visual H2SO4 10% DPPH 0,2%
UV λ 366 nm

Fase diam silika gel GF254 pra salut, fase gerak BAW (4:1:5), 1: fraksi etilasetat
(0,1 mg), 2, 3, 4, 5: isolat TO-A (masing-masing 1, 2, 3, 5 µg).

19 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Kompleks AlCl3

20 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Apakah semua flavonoid dapat dideteksi
dengan AlCl3

21 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

https://www.monaconatureencyclopedia.com/
orthosiphon-aristatus/?lang=en

https://www.noahgardencentre.com.sg/products/orth
osiphon-aristatus-purple-cats-whiskers-0-28m

22
D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
 23
D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
 AlCl3 5% Vs Sitroborat
PADA KERTAS WHATMAN NO 3 DENGAN METODE DOT-BLOT TES

1a 1b 2a 2b 3a 3b

4a 4b 5a 5b 6a 6b

7a 7b 8a 8b 9a 9b No Senyawa No Senyawa
10a 10b 11a 11b 12a 12b 1 Flavon 10 Asam-o-kumarat
13a 13b 14a 14b 15a 15b 2 3-OH-Flavon 11 Asam trans-m-kumarat
16a 16b 17a 17b 18a 18b 3 Luteolin-7-glukosida 12 Asam-p-kumarat

Tampak Visual
4 Apigenin-7-glukosida 13 Asam kafeat
5 kuersitrin 14 Asam ferulat
1 2 3 6 Rutin 15 Asam-o-hidroksi benzoat
4 5 6 7 α-tokoferol 16 umbiliferon
7 8 9 8 Kuersetin 17 Saponin
10 11 12 9 Asam askorbat 18 Stigmasterol

13 14 15

16 17 18

+AlCl3 5%

24 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 1 (Flavon), 2 (3-OH-Flavon), 8 (Kuersetin)

1 2 3 1 2 3

4 5 6 4 5 6

7 8 9 7 8 9

10 11 12 10 11 12

13 14 15 13 14 15

16 17 18 16 17 18

Sinar UV λ 254 nm Sinar UV λ 366 nm

(3) Luteolin-7-glukosida 1 2 3 1 2 3

4 5 6 4 5 6
(4) Apigenin-7-glukosida
7 8 9 7 8 9
(5) kuersitrin
10 11 12 10 11 12
(6) Rutin
13 14 15 13 14 15
(8) Kuersetin 16 17 18 16 17 18

+AlCl3 pada Sinar UV 366 nm +Sitroborat

pada Sinar UV λ 366 nm

25 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 Larutan Penampak Bercak Sitroborat?

 Larutkan 5 g asam sitrat P dan 5 g asam borat P dalam

etanol hingga 100 mL

Farmakope Herbal Indonesia, Edisi 1 tahun 2008, hal 183)

26 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)
Kompleks difenil-asam borat-etanolamin
(Naturstoffreagenz A)

 1% dalam MeOH
 Pada kromatogram
 Disemprotkan dikeringkan
 Menunjukan semua 3’-4’-dihidroksi-flavon dan
3’-4’-dihidroksi-flavonol
 Bercak jingga (UV atau tampak)
 4’-hidroksi-flavon dan 4’-hidroksi-flavonol
 Bercak hijau kuning

27 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Asam sulfanilat yang terdiazotasi

 Asam sulfanilat 0,3% dalam HCl 8% (25 ml) dicampur

dengan natrium nitrit 5% (1,5 ml) tepat sebelum
digunakan.
 Pada kromatogram
 Disemprotkan natrium karbonat 20%
dikeringkan
 Gugus hidroksi fenol terlihat sebagai bercak kuning,
jingga, atau merah

28 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Vanilin HCl

 5% dalam EtOH dicampur HCl pekat (4:1) tepat sebelum

digunakan.
 Disemprotkan dipanaskan
 Pola oksidasi lingkar-A floroglusinol dan lingkar-C jenuh (
umumnya pada kromatogram tidak tampak jika disinari
UV).
 Untuk katekin dan proantosianidin muncul segera,
flavanon dan dihidroflavonol terbentuk lebih lambat.

29 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Penampak bercak NP/PG no 28
(UV λ 365 nm)

30
Pereaksi NP/PG ???

31 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Penetapan Kadar Flavonoid ??

32 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Penetapan Kadar Flavonoid

 Farmakope Herbal Edisi 1 tahun 2008 (hal 173)

 Metode Ordon.
A. A. L. Ordon Ez. J. D. Gomez., M.A Vattuone, M.I. Isla. (2006) :
Antioxidant Activities of Sechium edule (jacq.) Swart Extracts, Food
Chem, 97, 452-458.

 Metode Chang
Chang, C-C.,Yang, H-M., Wen M-H, Chern C-J. (2002) : Estimation of
Total Flavonoid Content in Propolis by two Comlementary
Colorimetric method, Journal of food and Drug Analysis,Vol. 10, No.3,
178-182.

33 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

Penetapan Kadar Flavonoid

 Metode kolorimetri dengan penambahan aluminium klorida

 Inkubasi sampel dan pengukuran absorbansi sampel dengan
spektofotometri UV-Vis
 Pembuatan kurva kalibrasi dengan kuersetin sebagai standar
 Perhitungan kadar flavonoid

kuersetin

34 D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021)

 Diskusi …

Kuersetin

Kuersitrin

Isoviteksin

Rutin

D. Juanda_ FF UBK_Bandung (18/10/2021) 35

Terima kasih …
36 FF UBK_Bandung (18/10/2021)
D. Juanda_