Pada praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar fosfat dalam urin dan

darah. Tujuan dari praktikum kali ini ialah untuk menentukan kadar fosfat dalam
sampel urin dan darah sebagai deteksi awal osteoporosis menggunakan metode
spektrofotometri visible. Terdapat beberapa cara untuk mengukur jumlah fosfat
dalam sampel biologis urin, seperti Spektrofotmetri Massa, Spektrofotometri
Atom, Kromatografi Gas dengan kombinasi Spektrofotometri Massa, dan
berbagai metode lainnya. Namun metode yang paling mudah digunakan serta
akurat adalah modifikasi spektrofotometri visible dengan reagen molibdenum
biru, merupakan metode yang digunakan dalam praktikum penentuan kadar fosfor
dalam urin pada praktikum kali ini.

Penyakit osteoporosis merupakan penyakit dimana kepadatan tulang

berkurang secara progresif sehingga tulang menjadi rapuh dan mudah patah.
Tulang terdiri dari mineral-mineral seperti kalsium dan fosfat, dengan
berkurangnya kandungan zat tersebut yang disertai perubahan mikro arsitektur
tulang dan penurunan kualitas jaringan tulang yang dapat menimbulkan kerapuhan
tulang sehingga tulang mudah retak atau bahkan mudah patah (American College
of Rheumatology, 2007). Di dalam tubuh, fosfor dapat berasal dari banyak
sumber, sumber eksternal berasal dari makanan, seperti kacang-kacangan,
beberapa jenis sayur, dan gula. Sumber fosfor internal berasal dari pemecahan
fosfor dari tulang dalam siklus degradasi dan pembentukan kembali fosfor. Fosfor
akan dimetabolisme keluar dalam tubuh di hati, dikeluarkan dalam bentuk fosfat,
dan merupakan salah satu parameter medis yang penting untuk menentukan
berbagai diagnosis penyakit seperti osteoporosis atau kelainan pada hormon-
hormon tiroid.

Prinsip dari metode ini adalah fosfor anorganik dalam sampel yang bebas
protein direaksikan dengan Ammonium Molibdat [Mo(IV)] untuk membentuk
Ammonium Fosfomolibdat. Senyawa ini akan direduksi oleh agen pereduksi
untuk membentuk molibdenum blue. Molibdenum blue merupakan suatu senyawa
molibdenum heteropoli. Molibdat tidak akan tereduksi dalam kondisi ini. Warna
biru dalam senyawa ini dideteksi dengan menggunakan spektrofotometri.
 Sedangkan prinsip dari alat spektrofotometri visible ini didasarkan pada
absorbansi yang diperoleh dari eksitasi atom hingga kembali ke ground state
elektron pada fosfat. Sinar tampak atau visible adalah cahaya yang terlihat oleh
mata manusia atau warna komplementer. Pada praktikum ini, warna larutan yang
diukur adalah warna kebiruan yang berasal dari kompleks molibdat, dan
akandiserap pada panjang gelombang 620-800 nm. Karena setiap senyawa
memiliki panjang gelombang yang spesifik, panjang gelombang maksimum ada
pada 690 nm. Sesuai dengan prinsip Lambert-Beer, dengan spektrofotometri, hasil
pengukuran absorbansi yang didapat dapat digunakan untuk menghitung
konsentrasi fosfat yang ada dalam sampel.

Langkah pertama yang dilakukan adalah pembuatan reagen-reagen yang

dibutuhkan pada praktikum kali ini. Seperti asam sulfat 5 M, ammonium molibdat
2,5%, larutan TCA 5% dan 10%, serta larutan KI 20%,. Asam sulfat dibuat
dengan cara mengencerkan 13,8 ml H2SO4 96% 17,6 M) lalu menambahkan
aquades sampai 50 ml. Tujuan ditambahkannya H2SO4 pada larutan amonium
molibdat adalah untuk mengubah metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat
agar bereaksi dengan ammonium molibdat. Sedangkan pembuatan TCA berfungsi
untuk mengendapkan protein yang mungkin dapat mengganggu analisis dalam
sampel, karena sampel yang digunakan pada praktikum kali ini adalah sampel
organik.

Kemudian dibuat ammonium molibdat 2,5% dengan cara melarutkan

0,625 g. (NH4)2MoO4 dalam 25 ml air suling. Fungsi ammonium molibdat adalah
untuk mengikat fosfor lalu membentuk kompleks dalam urin. Selain itu dibuat
reagen KI 20% yang ditambahkan pada sampel yang mengandung asam sulfat dan
ammonium molibdat berfungsi sebagai agen pereduksi, ion iodida dari KI
merupakan suatu agen pereduksi yang cukup kuat sehingga akan terjadi proses
reduksi-oksidasi, iodida disini mereduksi kompleks ammonium molibdofosfat
yang berwarna kuning menjadi kompleks molibdenum yang berwarna biru. Selain
itu agen pereduksi yang dapat digunakan adalah aminonaftolsulfonat yang
penggunaannya digantikan oleh KI. Digunakan KI karena zat lebih aman
dibandingkan dengan aminonaftolsulfonat yang bersifat mutagenik.
 Selanjutnya dibuat larutan standar fosfor 100 ppm dengan cara
melarutkan 8.7694 mg. Larutan ini kemudian digunakan untuk membuat kurva
kalibrasi agar konsentrasi sampel fosfor dalam urin dapat ditentukan kadarnya.
KH2PO4 murni yang kering dalam 20 mL aquades lalu larutan dipipet 10 mL lalu
di encerkan dengan TCA 5% hingga 50 ml. lalu diencerkan kembali dengan
ditambahkan TCA 10% hingga menjadi beberapa konsentrasi yaitu 1 ppm, 2 ppm,
8 ppm, dan 16 ppm kemudian baku di masukkan pada well microplate dan di ukur
dengan spektrofotometri.

Dari pengukuran tersebut di dapatkan persamaan garis kurva baku y =

0.0052x+0.0459. Pada kurva baku ini hanya digunakan 4 titik dengan R 2 = 0,9993
Nilai R ini menunjukkan kekuatan hubungan antara dua variabel, di mana nilai R
yang mendekati 1 menunjukkan bahwa linearitas tercapai dan hubungan antar dua
variabel semakin kuat (yang berarti semakin tinggi konsentrasi, sinyal akan
semakin tinggi pula). Persamaan ini kemudian digunakan dalam menentukan
konsentrasi sampel. Persamaan linear bernilai positif menunjukkan bahwa
hubungan intensitas emisi instrumen berbanding lurus dengan konsentrasi.

Selanjutnya dilakukan preparasi sampel urin pertama-tama dengan

mengencerkan urin menjadi sepuluh kalinya dengan tujuan agar konsentrasi
sampel tidak terlalu pekat dan rentang konsentrasi semakin luas sehingga fosfat
dalam sampel dapat dibaca di spektrofotometri Visible. Kedalam semua well
microplate ditambahkan asam sulfat, ammonium molibdat dan KI. Asam sulfat
berfungsi untuk mengubah metafosfat dan pirofosfat menjadi ortofosfat agar
bereaksi dengan ammonium molibdat yang mana ammonium molibdat tersebut
akan membentuk kompleks ammonium fosfor molibdat berwarna kuning yang
kemudian tereduksi oleh KI menjadi kompleks berwarna biru yang kemudian
dapat dideteksi dengan spektrofotometer visible dengan panjang gelombang 690
nm. Spektrofotometer visibel ini digunakan untuk mengukur absorbansi dari hasil
molibdenum biru pada panjang gelombang tertentu. Intensitas warna biru yang
dihasilkan akan sebanding dengan jumlah fosfat yang terdapat dalam larutan
sampel. Sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa nilai
absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi sehingga semakin besar
nilai absorbansi yang didapat maka semakin besar pula konsentrasinya.

Dari hasil pengukuran 8 sampel urin yang diuji memiliki kadar fosfat yang
berada di bawah rentang normal yang memiliki kisaran 0,4-1,3 gram/L, dimana
kondisi ini dapat disebut sebagai hipofosofatemia, yaitu sedikitnya kadar fosfat
dalam darah. Kekurangan kadar fosfat dapat disebabkan karena defisiensi fosfat
yang terjadi karena kelaparan, kekurangan kalori-protein atau pun sindrom
malabsorpsi. Selain itu dapat pula disebabkan karena perpindahan fosfat ke
intraseluller yang biasa terjadi pada alkalosis metabolik atau respiratotik dan pada
pengelolaan ketoasidosis metabolik. Penyebab lainnya dapat pula akibat
pemberian kortikosteroid, kelainan hormon paratiroid, penggunaan diuretik, tidak
mengeluarkan urin alam waktu 24 jam, dan asupan vitamin D yang berlebih.

Simpulan

Dapat dilakukan penentuan kadar fosfor dalam urin menggunakan metode

spektrofotometri visible pada 8 sampel urin yang tersedia dari mahasiswa shift B
Farmasi 2016. Dari sampel yang tersedia, diketahui semua sampel menunjukkan
konsentrasi urin yang kurang dari batas normal 0,4-1,3 g/L.