ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

DARI BUAH WUALAE (ETLINGERA ELATIOR (JACK) R.M SMITH)

SERTA UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Untuk Memenuhi Sebagai Syarat

Memperoleh Derajat Sarjana (S-1)

Oleh:

AFIFAH AGRI ARYANA

O1A1 17 002

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2018
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI.......................................................................................................................i
DAFTAR GAMBAR........................................................................................................iii
ABSTRAK........................................................................................................................iv
ABSTRACT......................................................................................................................vi
BAB I.................................................................................................................................1
PENDAHULUAN.............................................................................................................1
A. Latar Belakang.......................................................................................................1
B. Rumusan Masalah..................................................................................................3
C. Tujuan Penelitian...................................................................................................4
D. Manfaat Penelitian.................................................................................................4
BAB II...............................................................................................................................5
TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................................................5
A. Tanaman Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith).........................................5
1. Klasifikasi..........................................................................................................5
2. Morfologi Wualae..............................................................................................5
3. Kajian Etnobotani Tanaman Genus Etlingera....................................................6
4. Kandungan Metabolit Sekunder Etlingera elatior..............................................8
5. Efek Farmakologi...............................................................................................9
B. Analisis Senyawa Metabolit Sekunder.................................................................10
1. Metode isolasi..................................................................................................10
2. Metode Identifikasi..........................................................................................14
C. Uji Aktivitas Antioksidan......................................................................................17
1. Radikal Bebas...................................................................................................17
2. Definisi Antioksidan.........................................................................................18
3. Metode Uji Aktivitas Antioksidan....................................................................19
D. Kerangka Konsep.................................................................................................22
BAB III............................................................................................................................23
METODE PENELITIAN.................................................................................................23

i
 A. Waktu danTempat Penelitian...............................................................................23
B. Jenis Penelitian.....................................................................................................23
C. Alat dan Bahan.....................................................................................................23
1. Alat...................................................................................................................23
2. Bahan...............................................................................................................24
D. Variabel Penelitian...............................................................................................24
1. Variabel Terikat................................................................................................24
2. Variabel Bebas.................................................................................................24
E. Definisi Operasional.............................................................................................24
F. Prosedur Penelitian...............................................................................................25
1. Pengambilan Sampel........................................................................................25
2. Preparasi Sampel..............................................................................................25
3. Ekstraksi...........................................................................................................27
4. Pemisahan dan Pemurnian................................................................................27
5. Identifikasi Isolat..............................................................................................28
6. Uji Aktivitas Antioksidan.................................................................................28
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................31

ii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.1 a) Tanaman wualae, b) Buah (sumber : dokumentasi pribadi)............6

Gambar 1.2 Diagram sederhana kromatografi kolom vakum................................13
Gambar 1.3 Struktur Asam Askorbat.....................................................................19
Gambar 1.4 Kerangka konsep penelitian...............................................................22

iii
 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Buah Wualae
(Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith) serta Uji Aktivitasnya Sebagai
Antioksidan

Afifah Agri Aryana

O1A1 17 002

ABSTRAK

Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) merupakan salah satu spesies dari
genus Etlingera yang dimanfaatkan dalam pengobatan tradisional. Ekstrak dari
buah wualae telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Penelitian
ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder
dari buah wualae serta menguji aktivitasnya sebagai antioksidan. Senyawa
diisolasi dengan menggunakan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
Kromatografi Kolom Vakum (KKV), dan Kromatografi Radial (KR). Senyawa
hasil isolasi diidentifikasi dengan teknik spektroskopi 1H dan membandingkan
data dengan referensi. Uji antioksidan ditentukan terhadap radikal bebas DPPH.
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan delapan variasi konsentrasi dari 200
μg/mL-1,5625 μg/mL. Dua senyawa yang berhasil diisolasi dan1 senyawa yang
berhasil diidentifikasi meliputi asam 4-Heksadekenoat (1) dan senyawa 2.
Senyawa 1 (10,43%) dan senyawa 2 (7,27%), tidak memiliki aktivitas antioksidan
terhadap DPPH. Senyawa 1 dan 2 tidak memiliki nilai IC50 karena %
penghambatan yang dimiliki setiap senyawa dibawah 50% sedangkan asam
askorbat sebagai standar dengan nilai IC50 25,63μg/mL. Secara umum, senyawa 1
dan senyawa 2 tidak aktif pada aktivitas antioksidan.

Kata Kunci : Isolasi, metabolit sekunder, Etlingera elatior, antioksidan.

iv
 Isolation and Identification of Secondary Metabolite Compounds from
Wualae (Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith) Fruit and Their Antioxidant
Activities

Afifah Agri Aryana

O1A1 17 002

ABSTRACT

Wualae (Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith) is a species of the genus Etlingera

that has been used as traditional medicine and spices, with antibacterial and
antioxidant properties. This research aimed to isolate and identify the secondary
metabolite compounds from wualaefruit as well as to evaluate their activities as
antioxidant. Extraction performed by maceration with ethanol as solvent.
Separation methods was carried out by Thin Layer Chromatography (TLC),
Vacuum Liquid Chromatography (VLC), and Radial Chromatography (RC)
techniques. Two isolated compounds were identified using 1H NMR spectroscopic
data and compared with literatures. Antioxidant activity determined against DPPH
and showed IC50 values by using various concentration from 200 μg/mL to 1.5625
μg / mL. Two fatty acid were successfully isolated and and identified as 4-
hexadecenoic acid (1) and compound 2. Compound 1 (10.43%) and compound 2
(7.27%) did not have antioxidant activity against DPPH with IC50 values were
under 50%, while ascorbic acid as standard showed IC50 values at 25.63 μg/mL.

Keywords : Isolation, secondary metabolite, Etlingera elatior, antioxidant.

v
6
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara dengan kekayaan hayati

terbesar yang memiliki lebih dari 30.000 spesies tanaman tingkat tinggi.

Hingga saat ini tercatat 7000 spesies tanaman telah diketahui khasiatnya

namun kurang dari 300 tanaman yang digunakan sebagai bahan baku industri

farmasi secara reguler. WHO pada tahun 2008 mencatat bahwa 68%

penduduk dunia masih menggantungkan sistem pengobatan tradisional yang

mayoritas melibatkan tumbuhan untuk menyembuhkan penyakit dan lebih

dari 80% penduduk dunia menggunakan obat herbal untuk mendukung

kesehatan mereka (Mukhriani, 2014).

Radikal bebas atau spesies oksigen reaktif telah terbukti sebagai agen

penyebab penuaan dan beberapa penyakit degeneratif seperti kanker,

aterosklerosis, jantung dan penyakit neurodegeneratif (Schinella dkk., 2010).

Meskipun produksi radikal bebas merupakan bagian integral dari

metabolisme normal, masih perlu dikendalikan secara memadai agar tidak

merusak struktur dan fungsi sel. Untuk tujuan ini, manusia mengandalkan

antioksidan yang diproduksi oleh tubuh. Terlepas dari antioksidan terkenal

seperti vitamin A, C, E dan karotenoid, polifenol tanaman (flavonoid,

katekin, asam fenolik, coumarin, anthocyanin dan tanin) juga disarankan

untuk mekanisme pertahanan dari radikal bebas (Larson, 1988 ).

1
 Obat tradisional mempunyai keuntungan yang dirasakan langsung

oleh masyarakat yaitu kemudahan untuk memperolehnya dan bahan

bakunya dapat ditanam dipekarangan sendiri, murah dan dapat diramu

sendiri di rumah. Hampir setiap orang indonesia pernah menggunakan

tumbuhan obat untuk mengobati penyakit atau meredahkan kelainan yang

timbul pada tubuh selama hidupnya, baik ketika masih bayi, kanak-kanak,

maupun setelah dewasa (Anonimous, 2001). Bahan alam asli Indonesia

banyak mengandung antioksidan dengan berbagai bahan aktifnya.

Penggunaan bahan alam asli Indonesia sebagai antioksidan diperlukan untuk

meningkatkan kualitas kesehatan masyarakat dengan biaya relatif terjangkau.

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibagi menjadi 2 yaitu antioksidan

alami dan antioksidan sintetik. Berbagai obat-obatan sintetis yang

mengandung antioksidan antara lain N-Asetil Sistein (NAC) dan vitamin C

(Werdhasari, 2014). Antioksidan alami merupakan senyawa antioksidan yang

terdapat secara alami. Sedangkan antioksidan sintetik merupakan senyawa

yang disintesis secara kimia. Salah satu sumber senyawa antioksidan alami

adalah tanaman dengan kandungan senyawa polifenol yang tinggi. Tanaman

yang memiliki potensi sebagai sumber antioksidan alami adalah wualae.

Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith) merupakan salah satu jenis

tanaman dari famili Zingiberaceae banyak digunakan dalam pengobatan.

Jaringan tanaman tersebut yang digunakan mulai dari rimpang, buah, dan

bunga. Secara empiris wualae biasanya digunakan masyarakat untuk

mengobati penyakit kulit, menambah cita rasa pada makanan, dapat dijadikan

2
 sebagai sabun alami. Masyarakat Sulawesi Tenggara memanfaatkan Wualae

dalam mengobati demam tifoid terutama bagian buah, dan batangnya. Secara

umum, jaringan tanaman ini mengandung senyawa bioaktif seperti polifenol,

alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, dan minyak atsiri yang memiliki potensi

sebagai antioksidan yang mampu menangkap adanya radikal bebas

(Handayani dkk., 2014).

Uraian di atas menunjukkan bahwa bagian tanaman wualae seperti

buah, bunga dan rimpang mengandung senyawa yang memiliki potensi

sebagai antioksidan. Selain itu, senyawa kimia yang diisolasi dari buah

tanaman ini masih sedikit yang dilaporkan. Berdasarkan pemaparan di atas,

maka peneliti akan mengisolasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat

dalam buah wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) dan menguji

aktifitas antioksidannya terhadap radikal bebas dengan menggunakan uji

DPPH.

B. Rumusan Masalah

Masalah yang dikaji dalam penelitian ini, antara lain sebagai berikut :

1. Senyawa murni apa yang dapat diisolasi dan diidentifikasi dari buah

tanaman E. elatior (Jack) R.M. Smith?

2. Bagaimanakah aktifitas antioksidan senyawa murni hasil isolasi dari

buah tanaman E. elatior (Jack) R.M. Smith) menggunakan metode

DPPH?

3
C. Tujuan Penelitian

Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah:

1. Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa murni dari ekstrak

buah tanaman E. elatior (Jack) R.M. Smith.

2. Untuk mengetahui aktifitas antioksidan senyawa murni hasil isolasi dari

buah tanaman E. elatior (Jack) R.M. Smith.

D. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa:

1. Bagi diri sendiri, menambah pengetahuan dan keahlian dalam isolasi

senyawa metabolit sekunder tanaman.

2. Bagi ilmu pengetahuan, memberikan informasi mengenai senyawa

metabolit sekunder yang terkandung dalam tanaman Etlingera elatior

dan aktifitasnya sebagai antioksidan

3. Bagi institusi, mewujudkan peran Universitas Halu Oleo dalam mengkaji

permasalahan yang terjadi di masyarakat terkait tanaman obat dengan

memanfaatkan kekayaan alam.

4. Bagi masyarakat, memberikan informasi ilmiah tentang tanaman Etlingera

elatior dalam bidang pengobatan.

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tanaman Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)

1. Klasifikasi

Klasifikasi tanaman wualae (E. elatior) adalah sebagai berikut

(Tjitrosoepomo, 2005) :

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Liliopsida

Ordo : Zingiberales

Famili : Zingiberaceae

Genus : Etlingera

Spesies : Etlingera elatior (Jack) R.M Smith

2. Morfologi Wualae

Tanaman tropis tahunan ini tumbuh merumpun dalam susunan tanaman

yang tidak terlalu rapat (Kusumawati, 2016). Wualae berwarna kemerahan

seperti jenis tanaman hias pisang-pisangan atau mirip sekali dengan tanaman

lengkuas/laos. Jika batang sudah tua, bentuk tanamannya mirip jahe, dengan

tinggi mencapai 5 m. Batang-batang semu bulat gilig, membesar di

pangkalnya, tumbuh tegak dan banyak, berdekat-dekatan, membentuk rumpun

jarang, keluar dari rimpang yang menjalar di bawah tanah. Rimpangnya tebal,

berwarna krem, kemerah-jambuan ketika masih muda. Daun 15-30 helai

tersusun dalam dua baris, berseling, di batang semu, helaian daun jorong

5
 lonjong, 20-90 cm × 10-20 cm, dengan pangkal membulat atau bentuk jantung,

tepi bergelombang, dan ujung meruncing pendek, gundul namun dengan

bintik-bintik halus dan rapat, hijau mengkilap, sering dengan sisi bawah yang

keunguan ketika muda (Angin, 2015).

Bunga berwarna merah, tumbuh diantara rumpun, tegak di atas batang

yang panjangnya 0,8-2,2 m, meyerupai gada. Buah wualae mirip nanas,

berwarna merah muda-tua, dan tidak bermahkota. Wualae akan berbunga dan

berbuah setelah berumur dua tahun (Kusumawati, 2016).

(a) (b)

Gambar 1.1 a) Tanaman wualae, b) Buah (sumber : dokumentasi pribadi)

3. Kajian Etnobotani Tanaman Genus Etlingera

Besarnya kontribusi senyawa bahan alam terhadap penemuan obat

paten tidak terlepas dari pendekatan yang dilakukan dalam pencariannya.

Salah satu pendekatan yang sangat membantu dalam pencarian senyawa aktif

dari alam adalah melalui kajian etnobotani, yaitu kajian berdasarkan

penggunaan tanaman tertentu oleh suatu kelompok masyarakat dengan resep

6
yang bersifat turun temurun atau lebih dikenal dengan obat tradisional.

Pendekatan ini minimalnya memberikan rasa aman atau hilangnya perasaan

takut keracunan karena bahan-bahan obat yang digunakan pernah dikonsumsi

sebelumnya. Keragaman etnobotani berbanding lurus dengan keragaman

kebiasaan suatu masyarakat. Setiap masyarakat dalam suatu kawasan tertentu

pasti memiliki cara dalam menjaga kesehatannya atau mempertahankan

hidupnya yang dilakukan secara turun temurun (Ruslin dan Sahidin, 2008 ).

Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) merupakan sumber

rempah lokal kota Palopo, Provinsi Sulawesi Selatan yang umumnya

digunakan sebagai bahan utama dalam berbagai macam makanan khas

Sulawesi Selatan yang tidak dapat ditemukan di daerah lain. Wualae

merupakan tanaman yang multifungsi mulai dari rimpang, batang, buah, dan

bunga. Bunga wualae dapat dimanfaatkan sebagai obat pada penyakit kulit,

penyembuhan gejala panas dalam dan disentri (Handayani, 2014).

Wualae dimanfaatkan oleh masyarakat Desa Petahunan, Semedo,

Karang Kemiri, Cikembulan dan Karang Klesem sebagai pemberi cita rasa.

Pemanfaatan tanaman wualae sebagai pemberi cita rasa dikarenakan dalam

tanaman wualae tersebut mengandung minyak atsiri, fenolik, flavonoid,

terpena, asam lemak, ester asam lemak tertentu, dan alkaloid. Bagian utama

pada minyak atsiri mengandung terpenoid. Zat terpenoid inilah penyebab

wangi, harum, atau bau yang khas pada minyak tumbuhan. Secara ekonomi,

senyawa tersebut penting sebagai pemberi cita rasa rempah-rempah di dalam

industri makanan (Apriliani dkk., 2014).

7
4. Kandungan Metabolit Sekunder Etlingera elatior

Bunga, batang, rimpang, dan daun E.elatior mengandung senyawa

bioaktif seperti polifenol, alkaloid, flavonoid, steroid, saponin dan minyak

atsiri (Handayani, 2014). Kandungan kimia berdasarkan hasil penelitian

Naufalin (2005) pada bunga, batang, rimpang, buah dan daun wualae antara

lain senyawa alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid, steroid,

dan glikosida yang berperan aktif sebagai antioksidan maupun antilarvasida.

Kandungan fitokimia bunga, batang, rimpang, buah dan daun

wualae antara lain senyawa alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid,

triterpenoid, steroid, dan glikosida. Buah dan daun merupakan salah satu

komponen yang terdapat pada tanaman wualae (E. elatior (Jack) R.M. Smith)

yang memiliki kandungan fenolik didalamnya (Ahmad dkk., 2015).

Kandungan kimia daun wualae adalah tanin, flavonoid, dan saponin

(Kusumawati, 2016). Senyawa fitokimia bunga wualae diketahui terdiri atas

alkaloid, flavonoid, polifenol, steroid, saponin, dan minyak atsiri (Muawanah

dkk., 2012).

Daun dari wualae mengandung kadar fenolik yang tinggi dan asam

askorbat, juga dapat digunakan sebagai antioksidan dan menghambat aktivitas

tirosin. Minyak atsiri dengan metode destilasi uap terisolasi dari tunas bunga

muda wualae. Dari hasil penelitian diperoleh bahwa komponen utama minyak

atsiri terdiri dari senyawa aldehid alifatik dan alkohol dengan dodecanol dan

dodecanal sebagai dua komponen yang paling banyak. Minyak atsiri yang

terkandung pada daun wualae yaitu ß pinene (19,7%), kariopilen (15,36%)

8
 dan sebagai senyawa utama ß farnesen (27.90%) sedangkan minyak atsiri

pada batang sebagian besar didominasi oleh 1,1-dodecanediol diasetat

(34,26%) dan dodecan (26,99%). Minyak atsiri dari bunga dan rimpang

mengandung senyawa utama yaitu 1,1-diasetat dodecanediol masing-masing

24,38% dan 40,37% dan siklododecan masing-masing 47,28% dan 34,45%

(Angin, 2015). Pemanfaatan E.elatior sebagai bahan obat berhubungan

dengan kandungan senyawa bioaktifnya atau kandungan metabolit

sekundernya (Silalahi, 2016).

5. Efek Farmakologi

Wualae (E. elatior (Jack) R.M. Smith) merupakan salah satu jenis

tanaman rempah-rempah yang sudah lama dikenal dan dimanfaatkan sebagai

obat-obatan berkaitan dengan khasiatnya yaitu sebagai bromhidrosis dan

halitosis. Tanaman wualae dapat pula dipakai untuk mengobati penyakit-

penyakit yang tergolong berat yaitu kanker dan tumor (Burhan dkk., 2016).

Bunga dan daun wualae memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram

positif maupun gram negatif. Ekstrak air daun wualae juga memiliki aktivitas

antioksidan (Kusumawati dkk.,2015).

Ekstrak etanol bunga wualae dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik

terhadap sel HeLa. Hasil uji sitotoksisitas yang lain menyebutkan bahwa

ekstrak etil asetat bunga wualae memiliki aktivitas penghambatan terhadap sel

CEM-SS dan MCF-7 dengan nilai IC 50 berturut-turut 4 mg/ml 6,25 mg/ml

(Lestari dan Ruswanto, 2015).

9
B. Analisis Senyawa Metabolit Sekunder

Analisis senyawa kimia bahan alam meliputi dua metode inti, kedua

metode tersebut yaitu metode isolasi dan metode identifikasi.

1. Metode isolasi

Isolasi adalah pemisahan suatu komponen kimia dari campuran.

Pemisahan ini didasarkan atas perbandingan sifat partisi komponen tersebut

terhadap adsorbennya (Harborne, 2006). Proses isolasi yang harus dilakukan

untuk memperoleh senyawa murni meliputi ekstraksi, fraksinasi dan pemurnian

(Sahidin, 2012).

a. Penyiapan Sampel

Sampel bahan alam buah wualae (E. elatior (Jack) R.M Smith)

yang telah dipanen, selanjutnya dibersihkan dari kotoran yang melekat

dengan cara dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan dengan cara

diangin-anginkan pada tempat yang tidak terkena sinar matahari secara

langsung kemudian dipotong kecil-kecil, diserbukkan dan siap untuk

diekstraksi ( Syarif dkk., 2015).

b. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya

dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Proses ekstraksi dihentikan

ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut

dengan konsentrasi dalam sel tanaman (Mukhriani, 2014). Ekstraksi

bertujuan untuk menarik komponen-komponen kimia yang terdapat dalam

suatu sampel dengan menggunakan pelarut tertentu (Harborne, 2006).

10
 Metanol merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga dapat

melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar. Metanol dapat menarik

alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid (Thompson, 1985). Dua jenis

ekstraksi yang sering digunakan adalah ekstraksi dingin dan ekstraksi

panas. Ekstraksi dingin dilakukan dengan maserasi, sedangkan ekstraksi

secara panas dilakukan dengan refluks, sokletasi dan destilasi uap

(Harborne, 2006).

Salah satu metode yang digunakan untuk penemuan obat

tradisional adalah metode ekstraksi. Pemilihan metode ekstraksi

tergantung pada sifat bahan dan senyawa yang akan diisolasi (Mukhriani,

2014). Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak

digunakan. Cara ini sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala industri.

Metode ini dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang

sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar.

c. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan cara cepat dan mudah untuk

melihat kemurnian suatu sampel maupun karakterisasi sampel. Cara ini

praktis untuk analisis skala kecil karena hanya memerlukan bahan yang

sangat sedikit dan waktu yang dibutuhkan singkat. Kemurnian suatu

senyawa bisa dilihat dari jumlah bercak yang terjadi pada plat KLT atau

jumlah puncak pada kromatogram KLT. Uji kualitatif dengan KLT dapat

dilakukan dengan membandingkan nilai Rf kromatogram sampel dengan

kromatogram senyawa standar (Handayani dkk., 2005).

11
 Kromatografi merupakan suatu metode fisik untuk pemisahan yang

didasarkan atas perbedaan afinitas senyawa-senyawa yang sedang

dianalisis terhadap dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Campuran

senyawa dapat mengalami adsorpsi dan desorpsi oleh fasa diam secara

berturut-turut sehingga secara berurutan fasa gerak juga akan melarutkan

senyawa-senyawa tersebut dan proses pemisahan dapat terjadi karena

campuran memiliki kelarutan yang berbeda di antara dua fasa tersebut

(Kristanti dkk, 2008).

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan suatu cara

pemisahan komponen senyawa kimia di antara dua fase, yaitu fase gerak

dan fase diam. Teknik tersebut hingga saat ini masih digunakan untuk

mengidentifikasi senyawa-senyawa kimia, karena murah, sederhana, serta

dapat menganalisis beberapa komponen secara serempak. Teknik standar

dalam melaksanakan pemisahan dengan KLT diawali dengan pembuatan

lapisan tipis dengan cara mencuplikan adsorben pada permukaan plat kaca

(kualitatif atau kuantitatif) (Hayani dan Sukmasari, 2005).

Tahapan setelah proses pengembangan cuplikan, langkah

selanjutnya yaitu mengamati noda yang telah dipisahkan. Jika diperoleh

noda yang berwarna maka dapat diamati langsung secara visual.

Sedangkan untuk noda yang tidak nampak, dapat dilihat dengan

menggunakan lampu ultraviolet (UV), umumnya pada panjang gelombang

254 nm – 366 nm (Sastrohamidjojo, 1985).

12
 Identifikasi noda dinyatakan dengan harga Rf (Retardation factor)

yang didefinisikan sebagai rasio jarak noda terhadap titik awal dibagi jarak

eluen terhadap titik awal (Anwar dkk., 1994).

d. Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-

senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip kromatografi kolom sama dengan

KLT, dimana senyawa-senyawa dalam campuran terpisahkan oleh karena

adsorpsi antara suatu padatan penyerap sebagai fase diam dan suatu pelarut

sebagai fase gerak (Sastrohamidjojo, 1985).

Diagram sederhana kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 1.2 Diagram sederhana kromatografi kolom vakum

(Hostettmann dkk., 1995).
e. Kromatografi Radial

Kromatotron memiliki prinsip sama seperti kromatografi klasik

dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal.

Kromatografi jenis ini menggunakan rotor yang dimiringkan dan terdapat

dalam ruang tertutup oleh plat kaca kuarsa, sedangkan lapisan

penyerapnya berupa plat kaca yang dilapisi oleh silika gel. Plat tersebut

13
 dipasang pada motor listrik dan diputar dengan kecepatan 800 rpm. Pelarut

pengelusi dimasukkan ke bagian tengah alat sehingga dapat mengalir dan

merambat karena gaya sentrifugal. Untuk mengetahui jalannya proses elusi

dimonitor dengan lampu UV. Gas Nitrogen dialirkan kedalam ruang plat

untuk mencegah pengembunan pelarut pengelusi dan mencegah sampel

teroksidasi. Pemasukan sampel itu diikuti dengan pengelusian

menghasilkan pita-pita komponen berupa lingkaran. Pada tepi plat, pita-

pita akan terputar keluar dengan gaya sentrifugal dan ditampung dalam

botol (Hostettmann dkk., 1995).

f. Pemurnian

Tujuan pemurnian adalah untuk menghilangkan atau memisahkan

senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa dapat

berpengaruh pada senyawa yang dikehendaki. Proses-proses pada tahapan

ini adalah pengendapan, pemisahan dua cairan yang tidak saling

bercampur, sentrifugasi, dekantasi, filtrasi, proses absorpsi, dan

penukaran ion (Ditjen POM, 1986).

2. Metode Identifikasi

a. Spektrofotometri Inframerah

Spektrofotometri inframerah digunakan untuk penentuan gugus

fungsi khususnya senyawa organik dan juga analisis kuantitatif. Dalam

spektrum inframerah posisi pita ditunjukkan sebagai bilangan gelombang

atau panjang gelombang. Gugus fungsional dapat ditentukan dengan

melihat bilangan gelombang atau panjang gelombangnya dimana bilangan

14
 gelombang yang lebih tinggi (4000–1300 cm-1) disebut daerah gugus

fungsional,serta daerah sidik jari (finger print region) di rentang 1300–400

cm-1(Sastrawijaya, 1985).

Spektrofotometri inframerah (IR) didasarkan pada penyerangan

sinar inframerah oleh molekul senyawa. Alat ini digunakan untuk

penentuan struktur, khususnya senyawa organik (Khopkar. 1990).

Cuplikan yang dianalisis dapat berupa zat cair atau zat padat. Bila radiasi

inframerah dilewatkan melalui cuplikan, molekul-molekul senyawa dapat

mengadsorpsi energi yang hanya dapat menyebabkan molekul mengalami

rotasi dan vibrasi (Khopkar. 1990).

Posisi pita spektrum IR posisi pita ditunjukkan sebagai bilangan

gelombang atau panjang gelombang. Gugus fungsional dapat ditentukan

dengan melihat bilangan gelombang dimana bilangan gelombang yang

lebih tinggi (4000 – 1300 cm-1) disebut daerah gugus fungsional. Dalam

daerah ini, gugus-gugus fungsional yang penting seperti –OH, -NH,-

C≡CH, =CN dan =C=O menunjukkan puncak yang khas, dan letak puncak

tersebut tidak berubah karena bentuk atau ukuran molekulnya (Fessenden

dan Fessenden. 1997). Tabel 2 memperlihatkan frekuensi uluran

inframerah beberapa gugus fungsi pada senyawa organik.

b. Spektrofotometer 1H dan 13C-NMR

Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance = Resonansi

Magnetik Inti) berhubungan dengan sifat magnet dari inti atom.

Spektroskopi NMR didasarkan pada penyerapan panjang gelombang radio

15
oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik, apabila molekul ini berada

dalam medan magnet yang kuat. Inti atom unsur-unsur dapat

dikelompokkan menjadi dua, yakni atom unsur yang mempunyai spin atau

tidak mempunyai spin. Spin inti akan menimbulkan medan magnet. Dari

resonansi magnet proton (RMP), akan diperoleh informasi jenis hidrogen,

jumlah hidrogen dan lingkungan hidrogen dalam suatu senyawa begitu

juga dari resonansi magnet karbon (RMC) (Khopkar, 2003).

Spektroskopi 1H-NMR dan 13C-NMR merupakan salah satu teknik

yang biasa digunakan untuk identifikasi senyawa metabolit sekunder.

1
Spektrum H-NMR memberikan informasi jenis hidrogen, jumlah
13
hidrogen, tetapan penjodohan dan multiplisitas sedangkan spektrum C-

NMR memberikan informasi tentang jumlah dan jenis atom karbon (Judi,

2013).

Metode ini memberikan banyak informasi mengenai kedudukan

gugus fungsi. Ada empat parameter yang dapat membantu

menginterpretasi spektra NMR. (1) pergeseran kimia, (2) penjodohan spin,

(3) tetapan penjodohan dan pola penjodohan, dan (4) integrasi (Khopkar,

2003).

Persamaan Double Bond Equivalent (DBE) dapat digunakan untuk

memudahkan dalam menentukan struktur suatu senyawa. Nilai ini dapat

memprediksi banyaknya ikatan rangkap, siklik, karbonil dan gugus nitro

dari suatu senyawa.

Perhitungan nilai DBE menggunakan persamaan (2) :

16
 DBE = X – 0,5Y + 0,5Z + 1 (2)

Keterangan :
X = atom tetravalen (C, Si)
Y = atom monovalen (H, halogen)
Z = atom trivalen (N, P) (Watson. 2009).
C. Uji Aktivitas Antioksidan
1. Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan suatu molekul yang memiliki elektron

tidak berpasangan dalam orbital terluarnya sehingga sangat reaktif.

Radikal ini cenderung mengadakan reaksi berantai yang apabila terjadi di

dalam tubuh akan dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan yang berlanjut

dan terus menerus (Wahdiningsih dkk., 2011). Radikal bebas adalah

sekelompok bahan kimia baik berupa atom maupun molekul yang

memiliki elektron tidak berpasangan pada lapisan luarnya atau kehilangan

elektron, sehingga apabila dua radikal bebas bertemu, mereka bisa

memakai bersama elektron tidak berpasangan membentuk ikatan kovalen

(Werdhasari, 2014).

Radikal bebas dalam jumlah berlebih mengakibatkan stress oksidatif.

Keadaan tersebut dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari

tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh yang mempercepat terjadinya

proses penuaan dan munculnya berbagai penyakit (Soeksmanto dkk.,

2007). Stress oksidatif yang diinduksi oleh radikal telah diketahui dapat

mempengaruhi terjadinya berbagai penyakit degeneratif seperti kanker,

penyakit jantung koroner dan penuaan dini. Tubuh yang tidak mempunyai

sistem pertahanan antioksidan dalam jumlah berlebih sehingga tubuh

17
 membutuhkan antioksidan dari luar melalui makanan atau asupan nutrisi

lainnya (Wahdiningsih,dkk., 2011)

2. Definisi Antioksidan

Antioksidan adalah molekul yang mampu menghambat oksidasi

dari molekul oksidan. Oksidasi merupakan reaksi kimia yang

memindahkan elektron dari satu substansi ke agen oksidan (Medicinus,

2011).

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibagi menjadi antioksidan

endogen, yaitu enzim-enzim yang bersifat antioksidan, seperti:

Superoksida Dismutase (SOD), katalase (Cat), dan glutathione peroksidase

(Gpx); serta antioksidan eksogen, yaitu yang didapat dari luar

tubuh/makanan. Berbagai bahan alam asli Indonesia banyak mengandung

antioksidan dengan berbagai bahan aktifnya, antara lain vitamin C, E, pro

vitamin A, organosulfur, α-tocopherol, flavonoid, thymoquinone, statin,

niasin, phycocyanin, dan lain-lain (Werdhasari, 2014). Antioksidan

diperlukan untuk mencegah stres oksidatif. Stres oksidatif adalah kondisi

ketidakseimbangan antara jumlah radikal bebas yang ada dengan jumlah

antioksidan di dalam tubuh. Radikal bebas merupakan senyawa yang

mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan dalam orbitalnya,

sehingga bersifat sangat reaktif dan mampu mengoksidasi molekul di

sekitarnya (lipid, protein, DNA, dan karbohidrat). Antioksidan bersifat

sangat mudah dioksidasi, sehingga radikal bebas akan mengoksidasi

18
 antioksidan dan melindungi molekul lain dalam sel dari kerusakan akibat

oksidasi oleh radikal bebas atau oksigen reaktif (Werdhasari, 2014).

Asam askorbat dapat dengan mudah teroksidasi, degradasi yang

dipercepat oleh panas, cahaya dan adanya kation logam berat

(Wawrzyniak dkk., 2005). Hal ini menjadikan asam askorbat sebagai

indikator kualitas penting dari bahan makanan dan berkontribusi terhadap

sifat antioksidan dari makanan (Pisoschi dkk.,2011), sehingga asam

askorbat juga memiliki peran penting sebagai pembanding beberapa

pengujian aktivitas antioksidan (Yodha, 2017). Struktur senyawa asam

askorbat adalah sebagai berikut:

Gambar 1.3Struktur Asam Askorbat

3. Metode Uji Aktivitas Antioksidan

a. Uji DPPH

DPPH merupakan suatu molekul yang berwarna ungu dalam

keadaan radikal dapat berubah menjadi stabil dengan warna kuning dengan

reaksi antioksidan dengan mendonorkan satu atom hydrogen pada DPPH

sehingga terjadi peredaman radikal bebas DPPH. Aktifitas antioksidan

biasanya dinyatakan sebagai konsentrasi menyebabkan hilangnya 50%

aktifitas DPPH (Dewi, dkk., 2014).

Uji kuantitatif dilakukan dengan menggunakan metode peredaman

radikal bebas DPPH. Aktivitas penangkapan radikal bebas dievaluasi

19
menggunakan sistem pendeteksian radikal bebas 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil (DPPH) yang memberikan absorbansi kuat pada 516 nm.

Sampel dan standar yang dilarutkan dalam metanol ditambahkan larutan

stok DPPH dengan perbandingan volume 1:1 dan diinkubasi selama 30

menit pada suhu kamar menggunakan wadah gelap yang dilapisi

alumunium foil dan tertutup. Serapan diukur pada panjang gelombang 516

nm. Persen penurunan absorbansi DPPH dihitung menggunakan rumus

(Marliani, dkk., 2014):

Ao −A s
I %= x 100 %
Ao

dimana :

I = Persen penurunan absorban DPPH

Ao = Absorbansi larutan stok DPPH

As = Absorbansi larutan sampel setelah ditambahkan DPPH

b. Uji ABTS

Asam 2,2’- Azinobis (3-etilbenzatiazolin)-6 sulfonat merupakan

substrat dari peroksidase, dimana ketika dioksidasi dengan kehadiran H 2O2

akan membentuk senyawa radikal kation metastabil dengan karakteristik

menunjukan absorbansi kuat pada panjang gelombang 414 nm. ABTS

merupakan senyawa larut air dan stabil secara kimia.Akumulasi dari

ABTS dapat dihambat oleh antioksidan pada medium reaksi dengan

aktivitas yang bergantung waktu reaksi dan jumlah antioksidan.

Kemampuan relatif antioksidan untuk mereduksi ABTS dapat diukur

dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 734 nm.

20
 Absorbansi maksimal juga dapat terjadi pada panjang gelombang

yang lain. Panjang gelombang yang mendekati daerah infra merah (734

nm) dipilih untuk meminimalkan interfensi dari absorbansi komponen

lainnnya. Hasil pengukuran dengan spektrofotometer selanjutnya

dibandingkan dengan standar baku antioksidan sintetik, yaitu trolox yang

merupakan analog vitamin E larut air. Hasil perbandingan ini

diekspresikan sebagai TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Activity).

TEAC adalah konsentrasi (dalam milimolar) larutan trolox yang memiliki

efek antioksidan ekuivalen dengan 1,0 mM larutan zat uji. TEAC

mencerminkan kemampuan relatif dari antioksidan untuk menangkap

radikal ABTS dibandingkan dengan trolox (Antolovich, 2002).

Metode ABTS memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode

lain, yaitu pengujian sederhana, mudah diulang, menggunakan alat yang

sederhana serta tidak menggunakan alat khusus untuk menghitung total

antioksidan (Yu, 2008).

c. Uji TRAP
Pengujian TRAP atau Total Radical-Trapping Antioxidant

Parameter bekerja berdasarkan pengukuran konsumsi oksigen selama

reaksi oksidasi lipid terkontrol yang diinduksi oleh dekomposisi termal

dari AAPH {2,2’-Azobis(2-aminidopropana) hidroklorida} untuk

mengukur total aktifitas antioksidan. Hasil uji ini diekspresikan sebagai

jumlah (dalam mikromol) radikal peroksil yang terperangkap oleh 1 liter

plasma. Pengukuran serum TRAP berdasarkan penentuan lamanya waktu

21
 yang diperlukan oleh serum uji untuk dapat bertahan dari oksidasi buatan

(Antolovich, 2002).

D. Kerangka Konsep

Kerangka konsep penelitian ini dapat dilihat pada gambar di bawah ini:

Radikal bebas

Sintetik Efek samping

Antioksidan merugikan
Alternatif

Biota laut Tanaman Buah

E.elatior

Ekstraksi

Ekstrak

Fraksinasi dan pemurnian

Isolat

Uji aktivitas Identifikasi

antioksidan senyawa

Nilai IC50 Isolat murni diidentifikasi

berdasarkan profil KLT,
Keterangan: spektrum 1H NMR

= Variabel terikat

= Variabel bebas

Gambar 1.4 Kerangka konsep penelitian

22
 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu danTempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmasi Fakultas Farmasi

Universitas Halu Oleo pada bulan Januari 2018 – Oktober 2018. Analisis

kromatografi dan spektrometri akan dilakukan di Laboratorium Farmasi

Fakultas Farmasi UHO dan Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam

Institut Teknologi Bandung.

B. Jenis Penelitian

Berdasarkan metodenya penelitian ini adalah penelitian eksperimen,

yaitu penelitian yang dilakukan pada laboratorium yang terkontrol untuk

mengisolasi kandungan metabolit sekunder tanaman E.elatior dan menguji

aktifitas antioksidannya.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah satu set alat destilasi

(Duran-Germany), satu set alat kromatografi kolom vakum (KKV), Alat

Kromatografi Radial (KR), vacuum rotary evaporator (Buchi Rotavapor),

oven (Gallenkamp Civilab-Australia), Timbangan analitik (Explorer

Ohaus), Plat KLT, Pipet tetes, Botol vial, Kertas saring biasa dan

whatman No.1, Pisau, Blender, Erlenmeyer (Pyrex), Lampu UV(Srahlen

Germany), Chamber, Kaca, Cutter, Spatula, Alat, Pinset, Mistar,

23
 Aluminium foil, Toples kaca, Pipa kapiler, Gelas ukur (Pyrex), Pipet ukur

(Pyrex), Filler, Kuvet, Spektrofotometer UV-VIS 20D, Spektrofotometer

NMR 1H dan 13C.

2. Bahan
Bahan yang digunakan pada peneltian ini adalah buah E.elatior,

Etanol (teknis), Metanol (teknis), n-Heksan (teknis), Etil asetat (teknis),

Silika gel 60 G F254 (E. Merck), Silika 60 G, Aquades, Serium sulfat

(CeSO4), asam askorbat, dan DPPH.

D. Variabel Penelitian

1. Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah senyawa murni atau isolat

yang diperoleh dan nilai IC50.

2. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak metanol yang

digunakan dan pengujian aktifitas antioksidan.

E. Definisi Operasional

Definisi operasional dalam penelitian ini sebagai berikut :

1. Metabolit sekunder yang dimaksud dalam penelitian ini adalah senyawa

murni/isolat sebagai hasil dari isolasi ekstrak buah tanaman E.elatior.

2. Eluen yang dimaksud dalam penelitian ini adalah campuran dua atau lebih

pelarut organik, baik yang sudah didestilasi maupun yang belum

didestilasi.

3. Kromatografi yang dimaksud dalam penelitian ini adalah teknik pemisahan

24
 senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan silika sebagai fasa diam

dan eluen sebagai fasa gerak, seperti KKV dan Kromatografi Radial, serta

dimonitoring dengan KLT.

4. Radikal Bebas yang dimaksud dalam penelitian ini adalah DPPH.

5. Metabolit sekunder yang dimaksud dalam penelitian ini adalah senyawa

murni/isolat yang diisolasi dari ekstrak metanol buah E.elatior.

6. Aktivitas antioksidan yang dimaksud dalam penelitian ini adalah aktivitas

dari metabolit sekunder sebagai antioksidan secara kuantitatif dengan

menggunakan metode DPPH.

F. Prosedur Penelitian

Penelitian ini terdiri dari pengambilan sampel, preparasi sampel,

ekstraksi, skrining fitokimia, pemisahan dan pemurnian, identifikasi isolat,

dan uji aktifitas antioksidan.

1. Pengambilan Sampel

Sampel buah wualae yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh

dari daerah Kelurahan Sambeani, Kecamatan Abuki, Kabupaten Konawe.

Setelah sampel dikumpulkan, kemudian sampel buah dipisahkan dari

tangkainya. Buah wualae yang dikumpulkan adalah sebanyak 19,04 kg.

2. Preparasi Sampel

Sampel buah wualae yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh

dari daerah Kelurahan Sambeani, Kecamatan Abuki, Kabupaten Konawe.

Setelah sampel dikumpulkan, kemudian sampel buah dipisahkan dari

tangkainya. Buah wualae yang dikumpulkan adalah sebanyak 19,04 kg.

25
Selanjutnya dilakukan sortasi basah yaitu menghilangkan kotoran dan

memisahkan buah yang sudah busuk. Selanjutnya dilakukan pencucian

dengan menggunakan air mengalir bersih untuk menghilangkan tanah dan

kotoran lainnya yang masih menempel pada sampel, pencucian diulang

sampai tiga kali untuk mengurangi jumlah mikroba yang tertinggal.

Kemudian dilakukan perajangan, untuk mempermudah proses

pengeringan, pengepakan dan penggilingan. Perajangan dilakukan dengan

pisau sehingga diperoleh irisan yang tipis. Semakin tipis bahan yang

dikeringkan, semakin cepat penguapan air sehingga mempercepat waktu

pengeringan (Prasetyo dan Inoriah, 2013; Ahmad dkk, 2015).

Tahap terakhir dilakukan pengeringan yang bertujuan untuk

mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan

dalam waktu yang lebih lama dengan cara mengurangi kadar air dan

menghentikan reaksi enzimatik. Pengeringan menggunakan cahaya

matahari yang ditutupi kain hitam (proses pelayuan) agar tidak merusak

senyawa aktif dalam sampel dan menghasilkan pengeringan secara merata.

Suhu pengeringan yang ideal adalah 50°C dengan ketebalan tumpukan 3-4

cm (Bahar, 2011). Kemudian dilakukan sortasi kering atau sortasi akhir

untuk memisahkan benda-benda asing setelah pengeringan seperti bagian

tanaman yang tidak diinginkan dan kotoran lainnya yang masih tertinggal

pada simplisia buah. Setelah itu dilakukan penyerbukan menggunakan

blender untuk mengubah ukuran simplisia menjadi lebih kecil sehingga

26
 memudahkan pada proses ekstraksi (Bahar, 2011). Serbuk simplisia yang

diperoleh sebanyak 1586,7 gram.

3. Ekstraksi

Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi.

Maserasi dilakukan dengan menyimpan serbuk batang wualae kedalam

dua wadah toples masing-masing sebanyak 1-2 kg dan mencampur dengan

pelarut metanol sebanyak 1-2 Liter hingga serbuk batang wualae tersebut

terendam dilakukan selama 1x24 jam. Setelah itu, maserat dipisahkan dari

ampas dengan penyaringan menggunakan corong Buchner lalu diuapkan

dengan rotary vacuum evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental.

4. Pemisahan dan Pemurnian

Pemisahan dan pemurnian kandungan kimia melalui Kromatografi

Kolom Vakum (KKV) dan kromatografi radial (KR). Setiap tahap

pemisahan dan pemurnian dipantau dengan Kromatografi Lapis Tipis

(KLT). Fasa diam berupa silika gel, sedangkan fasa gerak berupa

campuran pelarut organik (eluen). Pemisahan ekstrak terlebih dahulu

dilakukan dengan menggunakan KKV silika kolom sebanyak 30 gram

tinggi 10 cm pada kolom dan 1-2 gram sampel diimpregnasi, KKV

dilakukan sebanyak lima kali dan hasil KKV satu sampai lima digabung

hingga didapatkan lima fraksi besar KKV. Pemisahan selanjutnya

dilakukan dengan kromatografi radial dilakukan terhadap fraksi hasil

pemisahan yang lebih sedikit (maksimal 2 gram),dengan menggunakan

plat Kromatografi Radial 0,5 cm hingga 2 cm. Hasilnya diamati

27
 menggunakan kromatografi lapis tipis dengan melihat noda yang terbentuk

di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm serta disemprotkan penampak

noda serium sulfat (CeSO4) lalu dilakukan pemanasan. Senyawa murni

ditandai dengan hasil pemisahan yang tampak sebagai noda tunggal pada

pengamatan dengan KLT.

5. Identifikasi Isolat

Senyawa murni yang diperoleh diidentifikasi berdasarkan uji sifat

fisik, profil KLT, spektrum 1H dan 13C-NMR, dan spektrum infra merah.

Selanjutnya dilakukan elusidasi dan pembandingan data literatur yang ada

sehingga bisa diketahui struktur dan nama senyawa isolat.

6. Uji Aktivitas Antioksidan

a. Pembuatan Larutan DPPH 0,2 mM

DPPH merupakan suatu molekul yang berwarna ungu dalam

keadaan radikal dapat berubah menjadi stabil dengan warna kuning oleh

reaksi dengan antioksidan dengan mendonorkan satu atom hidrogen pada

DPPH sehingga terjadi peredaman radikal bebas DPPH. Aktivitas

antioksidan biasa dinyatakan sebagai konsentrasi yang menyebabkan

hilangnya 50% aktivitas DPPH (Dewi, dkk., 2014).

Pembuatan larutan DPPH, DPPH ditimbang sebanyak 7,88 mg.

Setelah itu, DPPH dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan DPPH

dilarutkan dengan DMSO sedikit demi sedikit hingga tanda tera.

Kemudian dikocok dan setelah itu larutan DPPH disimpan didalam botol

gelap pada suhu 4oC.

28
b. Pembuatan Larutan Stok Asam Askorbat 20.000 μg/mL

Pembuatan larutan asam askorbat sebagai kontrol positif, asam

askorbat ditimbang sebanyak 20 mg. Kemudian, dimasukkan kedalam

tabung eppendorf, setelah itu ditambahkan DMSO sebanyak 1 ml dan

selanjutnya divortex hingga larut.

c. Pengujian Antioksidan dengan Uji Kuantitatif

Aktivitas antioksidan senyawa-senyawa yang telah diisolasi dari

buah wualae akan diukur secara spektrofotometri menggunakan metode

DPPH (Blois, 1958) yang dimodifikasi ke dalam mikroplat 96 sumuran

(96-wells microplate) (Clarke dkk., 2013). Sebanyak 100 μL larutan

sampel (400 μg/mL dalam DMSO) dimasukkan ke dalam wells dan

kemudian ditambahkan 100 μL larutan DPPH (0,2 mM dalam DMSO).

Campuran sampel dan DPPH kemudian diinkubasi selama 30 menit pada

suhu ruangan dalam keadaan gelap dan diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 540 nm (Clarke dkk., 2013). Absorbansi yang diperoleh

kemudian dikoreksi terhadap absorbansi blanko yang merupakan

absorbansi sampel (100 μL) dan pelarut DMSO (100 μL). Kontrol pada

pengujian ini adalah larutan DPPH (100 μL) dan pelarut DMSO (100 μL).

Nilai yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung %

Penghambatan menggunakan persamaan :

(Absorbansi Kontrol - Absorbansi Sampel)

% Penghambatan = x
Absorbansi Kontrol

100 (3)

29
 Sampel uji yang menunjukkan aktivitas antioksidan dengan %

Penghambatan diatas 50% kemudian ditentukan nilai IC50 menggunakan

dua kali seri pengenceran pada konsentrasi 200 - 1,5625 μg/mL. Asam

askorbat digunakan sebagai kontrol positif pada pengujian ini.

30
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad A., Misra Laxmi,N., Gupta Madan,M., 1993, Hydroxyalk –(4Z)- Enoic
Acids and Volatile Components From The Seeds Of Zanthoxylum
Armatum, Journal Of Natural Products, 56(4).

Anonimous, 2001, Pemanfaatan Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan RI.

Dirjen POM. Jakarta.

Anwar, C., Purwono, B., Paranomo, H., D., Wahyuningsih, dan Tutik, D.
1994,Penuntun Praktikum Kimia Organik, Fakultas Matematika and Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Apriliani, A, Sukarsa, Hexa, A, H., 2014, Kajian Etnobotani Tumbuhan Sebagai
Bahan Tambahan Pangan Secara Tradisional Oleh Masyarakat Di
Kecamatan Pekuncen Kabupaten Banyumas, Scripta Biologica, 1(1).
Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., Berset, C., 1995, Use of a Free Radical
Method toEvaluate Antioxidant Activity, Lebends-Wiss, U-Technol, 28.

Departemen Kesehatan RI. 2008. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Jakarta:

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 8-9 : 11-12.

Dewi, N., Y., O., C., Ni., M., P., I Made., D., S., Asih., I., A., R., dan Wiwik, S.,
R., 2014., aktifitas antioksidan senyawa flavonoid ekstrak etanol biji
terong belanda (solanum bataceum, syn) dalam menghambat reaksi
peroksidasi lemak pada plasma darah tikus wistar, cakra kimia 2 (1)
Fessenden, R.J. dan Fessenden J.S., 1997, Dasar-Dasar Kimia Organik, Binarupa
Aksara, Jakarta

Habsah M, Ali AM, Lajis NH, Sukari MA, Yap YH, Kikuzaki H, Nakatani N
(2005b) Antitumour- promoting and cytotoxic constituents of Etlingera
elatior . Malays J Med Sci 12(1):6–12.

Harborne, J.B., 1996. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan, Edisi II, ITB Press, Bandung.

31
Harborne, J.B., 2006, pytochemical metods, Edisi IV, padmawinata, kosasih, Dr.,
Soediro, Iwang, Dr, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern
Menganalisa Tumbuhan, Edisi II, ITB Press, Bandung.

Handayani, V., Ahmad, A.R., dan Sudir, M., 2014. Uji Aktivitas Antioksidan
Ekstrak Metanol Bunga dan Daun Patikala (Etlingera elatior (Jack) R.M
(Smith) Menggunakan Metode DPPH, Pharmaci Science Research, 1(2)

Hayani, E.dan Sukmasari, M., 2005. Teknik Pemisahan Komponen Ekstrak

Purwoceng Secara Kromatografi Lapis Tipis. Buletin Teknik Pertanian,
10(2)

Hidayat, S.R., dan Napitupulu, R.M., 2015, Kitab Tumbuhan Obat, penerbit
Swadaya Grup : Jakarta.

Hostettmann, K., M. Hostettmann dan Marston A., 1995. Cara kromatografi

Preparatif: Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam, Penerbit ITB,
Bandung.
Judi, L. K., 2013, Isolasi Curcusone B dari Akar Jarak Pagar (Jatropha curcas
Linn) dan Evaluasi Aktivitas Biologisnya sebagai Antibiotik, Antioksidan
dan Antikanker, Skripsi, Universitas Halu Oleo, Kendari.

Marliani, L., Herni,K., dan Nur I., S., 2014, Aktivitas Antioksidan Daun Dan
Buah Jamblang (Syzigium Cumini L.) Skeel, Prosiding Seminar Nasional
Penelitian dan PKM Sains, Teknologi dan Kesehatan, ISSN 2089-3582:
201-206.

Mukhriani., 2014., Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi Senyawa

Aktif. Jurnal Kesehatan, VII (2): 361–367.

Ruslin dan Sahidin, 2008, Identifikasi dan Determinasi Tanaman Obat

Tradisional Masyarakat Sulawesi Tenggara pada Arboretum Prof.
Mahmud Hamundu, Majalah Farmasi Indonesia, 19(2): 101-107.

Sahidin, I., 2012. Mengenal Senyawa Alami, Unhalu Press, Kendari

Sastrawijaya. A. T. 1985. Penentuan Struktur Molekul. Jurusan Kimia IKIP

Surabaya. Cetakan Bina Ilmu Offse, Surabaya.

Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, UGM Press, Yogyakarta.

Werdhasari, A. 2014., Peran Antioksidan Bagi Kesehatan, Jurnal Biotek

32
Medisiana Indonesia., III (2): 59-68.

33