UNIVERSITAS INDONESIA

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
IDENTIFIKASI PEWARNAAN GRAM POSITIF DAN
PEWARNAAN SEDERHANA

MAKALAH

Disusun oleh:

Kelompok 15

Anissa Damaiyanti (1906397720)

Romauli Sihombing (1906289211)
Sabrina Fathiyah Halim (1906397821)
Samiyah Nida Al Kautsar (1906349330)

FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT

PROGRAM STUDI GIZI
UNIVERSITAS INDONESIA
2021
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya berkat
rahmat-Nya, kami dapat menyelesaikan makalah “Identifikasi Pewarnaan Gram Positif dan
Pewarnaan Sederhana” yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi dengan tepat waktu.
Makalah ini kami buat untuk memenuhi salah satu kriteria penilaian pada mata kuliah
Mikrobiologi.
Kami mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Trini Sudiarti, M.Si selaku dosen
pengampu mata kuliah Mikrobiologi, serta Dwi Oktaviana, S.Tp., M.Si dan Primasti
Nuryandari Putri M.KM selaku asisten laboratorium mata kuliah Mikrobiologi, yang telah
memberikan ilmu dan membimbing kami dalam menjalani mata kuliah Mikrobiologi dan
menyusun makalah ini.
Kami berharap makalah ini dapat memberikan wawasan yang lebih luas dan
bermanfaat bagi pembaca serta diri kami sebagai penulis. Mohon maaf apabila masih terdapat
banyak kesalahan dan kekurangan di dalam makalah kami. Dengan sepenuh hati, kami terima
kritik dan saran demi terwujudnya makalah yang lebih baik lagi. Sekian dan terima kasih.

Jakarta, 22 Maret 2021

Kelompok 15

2
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR 2
DAFTAR ISI 3

BAB 1 PENDAHULUAN 4
A. Latar Belakang 4
B. Rumusan Masalah 4
C. Tujuan Masalah 4

BAB 2 KAJIAN PUSTAKA 5

A. Olesan Bakteri 5
B. Pewarnaan Sederhana 5
C. Pewarnaan Gram Positif 6

BAB 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 8

A. Pembuatan Olesan bakteri 8
B. Teknik Pewarnaan Sederhana 10
C. Teknik Pewarnaan Gram 12
D. Pentingnya Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram 16
E. Mekanisme Reaksi Biokimia pada Pewarnaan Sederhana 16
F. Mekanisme Reaksi Biokimia pada Pewarnaan Gram 17

BAB 4 PENUTUP 19

DAFTAR PUSTAKA 20

3
 BAB 1
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Pengamatan dan pengenalan morfologi
mikroorganisme sangat dibutuhkan untuk mengidentifikasi jenis mikroorganisme
tersebut. Morfologi mikroskopik mikroorganisme akan lebih mudah dalam kondisi
tidak bergerak (fixed) dan berwarna. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati
bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi
ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.

B. Rumusan Masalah
1. Apa itu olesan bakteri, pewarnaan sederhana dan pewarnaan Gram?
2. Bagaimana cara melakukan olesan bakteri, pewarnaan sederhana dan pewarnaan
Gram?
3. Mengapa untuk identifikasi bakteri pewarnaan gram perlu dilakukan?
4. Pengamatan apa saja yang bisa digunakan sebagai parameter untuk
mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri tak dikenal?
5. Bagaimana mekanisme reaksi biokimia pada pewarnaan sederhana dan
pewarnaan bakteri gram positif ?

C. Tujuan Pembahasan
1. Mengetahui cara pewarnaan sederhana
2. Mengetahui cara pewarnaan gram positif
3. Mengetahui reaksi biokimia pada pewarna sederhana dan gram positif

4
 BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. Olesan Bakteri
Olesan atau apusan bakteri adalah lapisan tipis bakteri yang ditempatkan pada
kaca objek untuk pelaksanaan teknik pewarnaan. Olesan bakteri yang baik adalah
olesan yang, bila dikeringkan, muncul sebagai lapisan atau film tipis berwarna
keputihan (Cappuccino, J. C., Sherman, N, 2014). Mempersiapkan apusan bakteri
diperlukan untuk membantu mencegah kontaminasi kultur dan memastikan keamanan
bagi pembuatnya. Setiap langkah kerja dalam prosedur olesan bakteri memiliki alasan
penting, dan masing-masing harus diikuti dengan cermat sebagai prasyarat
keberhasilan pengamatan (Pommerville, J. C., 2018).

B. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan penggunaan pewarnaan tunggal (hanya
menggunakan satu jenis cat pewarna) untuk mewarnai organisme bakteri. Prinsip
kerja dari pewarnaan sederhana, yaitu : apusan bakteri diwarnai dengan satu reagen.
Pewarnaan dasar dengan kromogen bermuatan positif (zat-zat warna yang digunakan
bersifat alkali) lebih disukai karena asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel
tertentu membawa muatan negatif yang sangat menarik dan mengikat kromogen
kationik. Pewarnaan dasar yang paling umum digunakan adalah biru metilen, kristal
violet, dan carbol fuchsin. Tujuan pewarnaan sederhana adalah untuk menjelaskan
morfologi dan susunan sel bakteri (Tabel 2.1).

5
 .
Tabel 2.1 Bentuk umum dari bakteri
Sumber : Pollack, R. et al., 2009. LABORATORY EXERCISES IN MICROBIOLOGY, THIRD EDITION.

United States of America : John Wiley & Sons, Inc.

C. Pewarnaan Gram Positif

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang terjadi antara penerapan
dua pewarnaan dasar pada langkah dekolorisasi. Pewarnaan utamanya adalah kristal
violet. Pewarnaan gram memiliki perbedaan reaksi yang berkaitan dengan perbedaan
biokimia komposisi dinding sel bakteri. Gram positif memiliki dinding sel tebal dan
kaku yang berkaitan erat dengan peptidoglikan. Peptidoglikan merupakan
polisakarida yang terdiri dari dua subunit kimia yang hanya ditemukan pada dinding
sel bakteri. Subunit tersebut adalah N-acetylglucosamine dan N-acetylmuramic acid.
Terdapat ruang antara dinding sel dan membran plasma pada bakteri gram positif
yang disebut dengan ruang periplasmik. Ruang tersebut berisi lapisan granular, yang
terdiri dari asam lipoteichoic. Ketika lapisan peptidoglikan yang berdekatan
terbentuk, mereka akan berikatan silang oleh rantai pendek peptida melalui enzim
transpeptidase, sehingga menghasilkan bentuk dan kekakuan dinding sel. Kondisi
tersebut membuat kompleks kristal violet-yodium menjadi terjebak, sehingga dinding
gram positif tidak terlalu rentan terhadap dekolorisasi. Gram positif pada organisme
yang mempertahankan kompleks kristal violet-iodine akan terlihat berwarna ungu
setelah penghilangan warna dan pewarnaan ulang.

6
 Gambar 2.2 Struktur dinding sel bakteri

Sumber: Granato, P., Morton, V. and Morello, J., 2019. Laboratory manual and workbook in
microbiology. 12th ed. New York: McGraw-Hill Education.

7
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Olesan Bakteri

a. Alat dan Bahan
1. Biakan murni (Escherichia coli , Staphylococcus aureus)
2. Aquades steril
3. Jarum ose
4. Gelas Objek
5. Alkohol 70%
6. Pembakar spiritus

b. Cara Kerja
1. Bersihkan gelas objek dengan alkohol 70% sampai bebas lemak.
2. Ambil beberapa ose akuades steril dan letakan di atas permukaan gelas
objek.

Gambar 1.1. Peletakkan aquades steril pada permukaan gelas objek.

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed.,
Pearson Education.

3. Ambil sedikit biakan bakteri dan letakan dalam tetesan aquades

2
ratakan campuran tersebut sampai seluas 1𝑐𝑚

8
 Gambar 1.2. Pencampuran biakan bakteri dan aquades
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual.
10th Ed., Pearson Education.

4. Biarkan mengering dengan sendirinya.

Gambar 1.3. Pengeringan olesan bakteri.

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual.
10th Ed., Pearson Education.

5. Fiksasi dengan cara melewatkan gelas objek di atas nyala api spiritus 3
– 4 kali

9
 Gambar 1.4. Fiksasi Olesan Bakteri.
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual.
10th Ed., Pearson Education.

B. Teknik Pewarnaan Sederhana

a. Alat dan Bahan
1. Biakan murni (Escherichia coli , Staphylococcus aureus)
2. Aquades steril
3. Larutan kristal violet, Metilen biru, karbol fuchsin
4. Gelas objek
5. Jarum ose
6. Alkohol 70%
7. Pembakar spiritus

b. Cara Kerja
Berikut adalah cara kerja dari Uji Pewarnaan Sederhana menurut Cappuccino,
J. dan Sherman, N (2014):

1. Siapkan preparat olesan bakteri

2. Tempatkan preparat di atas nampan pewarnaan dan teteskan larutan,
menggunakan waktu pemaparan yang sesuai untuk masing-masing:
carbol fuchsin 15 - 30 detik, kristal violet 20 - 60 detik, metilen biru 1 -
2 menit (ditunjukkan pada Gambar 2.1).

Gambar 2.1 Penetesan Larutan Metilen Biru

10
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed.,
Pearson Education.

3. Cuci dengan air aquades mengalir secara perlahan dengan air untuk
menghilangkan sisa cat. Selama langkah ini, tahan slide sejajar dengan
aliran air. Dengan cara ini dapat mengurangi hilangnya organisme dari
sediaan.

Gambar 2.2 Mencuci Preparat Dengan Air Aquades Mengalir

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed.,
Pearson Education.

4. Dengan menggunakan kertas bibulous atau kertas hisap, tepuk-tepuk

hingga kering.

Gambar 2.3 Pengeringan dengan Kertas Bibulous

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed.,
Pearson Education.

5. Amati di bawah mikroskop dengan menggunakan pembesar 1000x

menggunakan minyak imersi.
6. Gambar dan catat apa yang diamati.

11
 Gambar 2.4 Mikrograf dari Morfologi Bakteri
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed.,
Pearson Education.

C. Teknik Pewarnaan Gram

a. Alat dan Bahan:
1. Biakan murni (E. Coli, Staphylococcus aureus)
2. Gelas objek

12
 3. Aquades steril
4. Larutan hucker’s Crystal violet (Gram A)
5. Larutan mordan lugol’s iodine (Gram B)
6. Larutan 95% etil alkohol (Gram C)
7. Larutan safranin (Gram D)
8. Jarum ose
9. Alkohol 70%
10. Pembakar spiritus
b. Cara Kerja
1. Buat preparat olesan bakteri.
2. Teteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri dan
diamkan selama 1 menit.

Gambar 3.1. Peletakan larutan kristal violet pada olesan bakteri.

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual.
10th Ed., Pearson Education.

3. Cuci dengan air mengalir, lalu keringkan dengan kertas hisap secara
hati-hati.

13
 Gambar 3.2. Mencuci preparat dengan air aquades mengalir
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual.
10th Ed., Pearson Education.

4. Teteskan larutan Gram B biarkan 1 menit lalu bilas kemudian

keringkan dengan kertas hisap.

Gambar 3.3. Peletakkan dan Pencucian Larutan Gram B pada

preparat
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory
Manual. 10th Ed., Pearson Education.

5. Dekolorisasi dengan 95% etil alkohol. Jangan menghilangkan warna

secara berlebihan. Tambahkan reagen setetes demi setetes sampai
alkohol hampir jernih, hanya menunjukkan semburat biru. Lakukan
selama 30 detik, lalu bilas.

14
 Gambar 3.4. Peletakkan dan Pencucian Larutan Gram D pada
preparat.
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory
Manual. 10th Ed., Pearson Education.

6. Teteskan dengan larutan Gram D biarkan 30 detik, bilas kemudian

keringkan.

Gambar 3.5. Peletakkan dan pencucian larutan gram E pada preparat

Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory
Manual. 10th Ed., Pearson Education.

7. Keringkan dengan kertas bibulous.

Gambar 3.6. Pengeringan dengan kertas bibulous.

15
 Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory
Manual. 10th Ed., Pearson Education.

8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x menggunakan

minyak imersi dan gambarkan.

D. Pentingnya identifikasi bakteri dengan pewarnaan gram

Pewarnaan diferensial yang paling penting dan banyak digunakan untuk
bakteri adalah pewarnaan Gram yaitu untuk karakterisasi fenotipik bakteri. Pewarnaan
gram sel bakteri dibagi menjadi dua kelompok utama, yaitu gram positif dan gram
negatif. pewarnaan menjadi alat yang penting untuk klasifikasi dan diferensiasi
mikroorganisme. Prosedur pewarnaan membedakan organisme dari domain Bakteri
menurut struktur dinding sel. Pewarnaan atau pengecatan gram merupakan alat yang
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi secara universal. Laboratorium
diagnostik memanfaatkan pewarnaan gram untuk, mempelajari mikroorganisme
dalam kultur dan pewarnaan serta pemeriksaan apusan yang dibuat langsung dari
spesimen klinis.

E. Mekanisme reaksi biokimia pada pewarnaan sederhana

Gambar 3.7 Pewarnaan Dasar yang memiliki kromogen positif dan ion hidroksida negatif.
Sumber :Petersen, J. a. (2016). Laboratory Exercises in Microbiology: Discovering the Unseen World
Through Hands-On Investigation. CUNY Academic Works. Retrieved from
http://academicworks.cuny.edu/qb_oers/16

16
 Kromogen (kadang-kadang disebut kromofor) adalah ion berwarna. Jika
kromogen bermuatan positif, ion lawannya adalah ion hidroksida bermuatan negatif
(OH-). Karena sebagian besar struktur sel memiliki muatan negatif, kromogen
berwarna yang bermuatan positif akan tertarik ke sel yang bermuatan negatif. Hasil
dari interaksi ini adalah sel yang mempertahankan warna dan latar belakang tetap
tidak berwarna.
Jika kromogen bermuatan negatif, ion lawannya adalah hidrogen (H+).
Kromogen negatif akan ditolak oleh sel yang bermuatan negatif dan sel akan tetap
tidak berwarna dengan latar belakang gelap. Karena sel biasanya memiliki dinding sel
yang bermuatan negatif, kromofor positif dalam pewarna dasar cenderung menempel
pada dinding sel, menjadikannya pewarnaan positif. Dengan demikian, pewarna dasar
yang umum digunakan seperti fuchsin dasar, kristal violet, hijau perunggu, biru
metilen, dan safranin biasanya berfungsi sebagai pewarna positif.

F. Mekanisme reaksi biokimia pada pewarnaan Gram

Gambar 3.8 Pengamatan mikroskopis sel pada langkah-langkah prosedur pewarnaan gram
Sumber: Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2005. Microbiology-A laboratory
Manual. 6th Ed., Pearson Education.

Pewarnaan diferensial termasuk pewarnaan gram memerlukan minimal empat

reagen. Reagen pertama disebut dengan pewarnaan primer dimana menggunakan
reagen Crystal Violet (Hucker's) yang digunakan pertama kali dan menghasilkan noda
ungu pada semua sel. Reagen kedua adalah mordan berupa reagen iodium yang
digunakan untuk mengintensifkan warna noda primer. Selain itu, reagen mordan juga
berfungsi sebagai agen pembunuh. Prosedur ini dilakukan dengan mengikat noda

17
 primer, sehingga membentuk kompleks yang tidak larut yaitu kristal-violet-iodine
(CV-I). CV-I berfungsi untuk memperkuat warna noda. Pada titik ini, semua sel akan
tampak ungu kehitaman. Reagen ketiga merupakan agen penghilang warna
(dekolorisasi) berupa Ethyl Alcohol. 95% reagen ini memiliki fungsi ganda sebagai
agen dehidrasi protein dan sebagai pelarut lipid. Reaksi ini ditentukan oleh dua faktor,
yaitu konsentrasi lipid dan ketebalan lapisan peptidoglikan pada dinding sel bakteri.
Lapisan peptidoglikan yang tebal pada sel gram positif bertanggung jawab atas retensi
kompleks CV-I yang lebih ketat, karena pori-pori menjadi lebih kecil karena efek
dehidrasi alkohol. Oleh karena itu, kompleks pewarnaan primer yang terikat erat sulit
dihilangkan, sehingga sel-selnya tetap berwarna ungu. Sedangkan, gram negatif pada
tahap ini kehilangan warnanya. Reagen terakhir, yaitu counterstain yang berupa
Safranin. Safranin digunakan untuk mewarnai sel-sel yang sebelumnya telah
dihilangkan warnanya pada sel gram negatif. Sementara sel gram positif hanya
mempertahankan warna ungu dari noda primer.
G. Jenis Bakteri Gram Positif
GRAM POSITIF KOKUS:
Jenis bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah famili Micrococaceae,
Streptococcaceae, dan Staphylococcus. Ketiga famili tersebut akan dijelaskan sebagai
berikut:

- Micrococcus
Bakteri Micrococcus berbentuk bulat dengan hidup secara bergerombol tidak
beraturan atau membentuk paket atau tetrad. Micrococcus merupakan bakteri
gram positif yang bersifat aerobik, dan katalase positif. Contoh dari bakteri ini
adalah Micrococcus luteus yang hidup sebagai patogen.
- Streptococcaceae
Bakteri Streptococcus memiliki bentuk seperti bola yang hidup secara
berpasangan, atau membentuk rantai pendek dan panjang. Cara hidup
Streptococcus tergantung dari spesies dan kondisi pertumbuhannya.
Streptococcus merupakan bakteri gram positif yang bersifat homofermentatif,
dan beberapa spesies memproduksi asam laktat secara cepat pada kondisi
anaerob. Contoh dari bakteri ini adalah Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, dan Streptococcus agalactiae.

18
 Gambar 3.9 Streptococcus agalactiae
Sumber: Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado:
Morton.
- Staphylococcus
Bakteri Staphylococcus memiliki bentuk seperti bola yang terdapat dalam
bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur.
Untuk pertumbuhannya, bakteri ini membutuhkan nitrogen organik (asam
amino) dan bersifat anaerobik fakultatif. Contoh dari bakteri ini adalah
Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis.

Gambar 3.10 Staphylococcus aureus

Sumber: Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado:
Morton.

- Enterococcus

19
 Bakteri Enterococcus memiliki bentuk bulat yang memanjang dalam bentuk
tunggal atau rantai pendek. Enterococcus bersifat katalase-negatif dan
anaerobik fakultatif. Contoh dari bakteri ini adalah Enterococcus faecalis yang
hidup sebagai patogen.
Gram Positif Batang:
Selain berbentuk kokus, bakteri gram positif juga memiliki jenis yang berbentuk
batang. Beberapa bakteri jenis ini memiliki kepentingan pada lingkungan, industri,
dan klinis. Jenis bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah famili Bacillus,
Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus dan Mycobacterium. Famili tersebut
akan dijelaskan sebagai berikut.
- Bacillus
Bacillus merupakan bakteri yang berkelompok dengan besar dan heterogen.
Batang Bacillus berbentuk dalam tunggal atau rantai. Bakteri ini bersifat
aerobik atau anaerobik fakultatif dan kebanyakan positif katalase. Bacillus
menghasilkan endospora secara aerob. Contoh dari bakteri ini adalah Bacillus
anthracis, Bacillus subtilis dan Bacillus cereus

Gambar 3.11 Bacillus cereus

Sumber: Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado:
Morton.

- Clostridium
Clostridium merupakan bakteri yang hidup secara tunggal, berpasangan,
maupun rantai. Sebagian besar bakteri ini bersifat anaerob obligat, tetapi ada
beberapa yang mikroaerofil. Clostridium juga memiliki sifat katalase-negatif.
Bakteri ini menghasilkan endospora, tetapi tidak secara aerobik. Contoh dari

20
 bakteri ini adalah Clostridium tetani ,Clostridium botulinum, Clostridium
perfringens, dan Clostridium difficile.

Gambar 3.12 Clostridium tetani

Sumber: Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado:
Morton.
- Corynebacterium
Sering berbentuk klub, tunggal, berpasangan, palisade, atau cluster yang tidak
beraturan. Bakteri ini bersifat katalase-positif dan fakultatif anaerobik, tetapi
ada juga yang aerob. Contoh dari bakteri ini adalah Corynebacterium
diphtheria.
- Lactobacillus
Lactobacillus terkadang berbentuk rantai. Bakteri ini bersifat Katalase-negatif
dan Oksidase-negatif. Lactobacillus tidak memiliki endospora. Contoh dari
bakteri ini adalah Lactobacillus spp.
- Mycobacterium
Mycobacterium merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang
melengkung atau lurus. Selain itu, bakteri jenis ini terkadang memiliki cabang
atau serabut. Umumnya pada tahap awal pertumbuhan, bakteri ini tahan
terhadap asam. Mycobacterium memiliki sifat aerobik dan katalase-positif.
Seperti Lactobacillus, bakteri ini juga tidak memiliki endospora. Contoh dari
bakteri ini adalah Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae.

21
 Gambar 3.13 Mycobacterium tuberculosis
Sumber: Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado:
Morton.

- Listeria
Famili bakteri ini berbentuk batang dengan sifat anaerob fakultatif. Contoh
dari bakteri ini adalah Listeria monocytogenes.
H. Limitasi Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Gram Positif
Pada gram positif lebih sulit untuk menghilangkan warnanya dibandingkan
dengan gram negatif, hal ini karena gram positif memiliki banyak lapisan
peptidoglikan sehingga menahan molekul asam teichoic. Asam teichoic bereaksi
dengan kristal violet dan yodium yang berguna dalam proses pewarnaan ini.
Kemudian, kompleks molekul kristal violetiodine-teichoic acid terbentuk dan
menghasilkan senyawa kompleks yang besar sehingga membuat proses gram positif
sulit untuk dihilangkan. Selain itu, ketika gram positif dicampurkan dengan alkohol
maka alkohol tidak dapat bereaksi dengan mudah untuk menghilangkan kristal violet.
Sedangkan, jika alkohol dicampurkan pada gram negatif maka akan mudah untuk
menghilangkan kristal violet karena lapisan luar lipopolisakarida dari dinding sel
gram negatif memiliki sedikit lapisan sehingga mudah larut dan mempercepat
penghilangan noda primer kristal violet (Pollack, R. A., et.al, 2009).

I. Limitasi Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana adalah metode yang relatif cepat dan berguna untuk menguji
keberadaan, menentukan bentuk, atau menentukan jumlah bakteri \ yang ada dalam
sampel. Namun pewarnaan ini umumnya melibatkan langkah pewarnaan tunggal,
sehingga tidak dianggap diferensial atau diagnostik dan akan memiliki kegunaan
terbatas, atau dalam kata lain metode ini tidak memberikan banyak informasi tentang
sel selain dari karakteristik morfologi bakterinya. Pewarnaan sederhana juga akan
membuat semua organisme dalam sampel tampak berwarna sama, meskipun sampel
tersebut mengandung lebih dari satu jenis organisme, sehingga melalui pewarnaan
sederhana, kita tidak dapat mengklasifikasikan jenis organisme tertentu.

J. Jawaban Pertanyaan Presentasi

22
a. Faktor apa saja yang dapat mempengaruhi pewarnaan sederhana dan
pewarnaan gram?
- Jika hasil dari olesan bakteri terlalu kental, maka proses penghilangan
warna yang benar tidak dapat dilakukan.
- Lalu jika pada proses fixing heat dalam proses olesan bakteri terlalu
panas maka akan membuat dinding sel pecah.
- Konsentrasi dan kesegaran reagen juga dapat mempengaruhi kualitas
larutan.
- Pada saat Pencucian dan pengeringan noda di antara
langkah-langkahnya harus konsisten dan hati-hati. Karena apabila air
berlebih atau tertinggal di kaca objek akan membuat reagen encer
- Pewarnaan Gram hanya dapat diandalkan pada sel dari kultur yang
berada dalam fase pertumbuhan eksponensial. Budaya yang lebih tua
mengandung lebih banyak sel yang pecah dan mati. Sel dari kultur
lama dapat menodai Gram negatif meskipun bakterinya Gram positif.
b. Pada reagen counterstain, mengapa warna pada gram negatif berubah menjadi
pink sedangkan gram positif tetap mempertahankan warna ungunya dari
primary stain?

Jawab : Pada pewarnaan diferensial termasuk pewarnaan gram memerlukan

minimal empat reagen, berbeda dengan pewarnaan sederhana yang hanya
menggunakan satu reagen. sehingga dalam pewarnaan gram terdapat warna
primer yang menggunakan reagen Crystal Violet menghasilkan warna ungu.
sedangkan pada Pada reagen counterstain menggunakan pewarna Safranin.
Safranin merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berwarna merah
berfungsi sebagai pemberi warna mikroorganisme non target. Karena target
nya adalah pewarnaan gram positif menyebabkan Bakteri gram positif tetap
berwarna ungu karena tidak jenuh sehingga tidak mampu lagi mengikat cat
gram dan Bakteri gram negatif berwarna merah karena cat sebelumnya telah
dilunturkan oleh reagen sebelumnya, maka akan mampu mengikat cat
Safranin.

23
c. Disebutkan bahwa kompleks kristal violet-iodium yang terjebak menyebabkan
dinding gram positif menjadi tidak terlalu rentan terhadap dekolorisasi.
Mengapa hal tersebut bisa terjadi? Dan bagaimana korelasi antara keduanya?

Jawab: Gram positif menjadi tidak terlalu rentan terhadap dekolorisasi karena
gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan ikatan silang yang besar.
ikatan silang yang besar tersebut dipengaruhi karena adanya kandungan asam
teichoic. asam teichoic inilah yang menjebak kompleks kristal violet-iodine
bisa lebih efektif. karena asam teichoic memiliki fungsi salah satunya itu
mencegah kerusakan dinding yang luas dan kemungkinan lisis sel. Kemudian
Lapisan peptidoglikan yang tebal pada sel gram positif bertanggung jawab atas
retensi kompleks kristal violet-iodium yang lebih ketat, karena pori-pori
menjadi lebih kecil karena efek dehidrasi alkohol. Oleh karena itu, kompleks
pewarnaan primer yang terikat erat sulit dihilangkan, sehingga sel-selnya tetap
berwarna ungu.

d. Pada reaksi dekolorisasi pewarnaan gram, disebutkan faktor yg berperan yaitu

konsentrasi lipid dan ketebalan lapisan peptidoglikan pada dinding sel bakteri.
konsentrasi lipid dan ketebalan peptidoglikan yang seperti apa yang
dibutuhkan pada reaksi ini?

Jawab: Setiap bakteri baik gram negatif maupun gram positif memiliki
konsentrasi lipid dan peptidoglikan yang berbeda. Komposisi dinding sel gram
negatif terdiri dari kandungan lipid yang tinggi, berbeda dengan komposisi
dinding sel bakteri gram positif yang mengandung lipid rendah. Kemudian,
bakteri Gram Negatif mempunyai sistem membran yang ganda dengan
membran plasma bakteri dilindungi membran luar permeabel, bakteri negatif
juga memiliki dinding sel peptidoglikan di antara membran luar dan membran
dalam. Sementara bakteri gram positif hanya memiliki membran plasma yang
tunggal dengan dikelilingi oleh dinding sel yang tebal dari peptidoglikan.
Hampir 90% dinding sel bakteri gram positif ini tersusun dari peptidoglikan.
Jadi, konsentrasi lipid dan ketebalan peptidoglikan yang digunakan pada
reaksi ini adalah tergantung terhadap jenis bakteri gramnya.

24
 BAB IV
PENUTUP

Uji Pewarnaan Sederhana merupakan salah satu uji biokimia yang dapat
dilakukan untuk menjelaskan morfologi dan susunan sel bakteri, seperti bacilli, spiral,
dan cocci yang dilakukan dengan menggunakan pewarnaan tunggal. Sedangkan gram
positif merupakan uji biokimia pada organisme yang mempertahankan kompleks
kristal violet-iodine dan hasilnya akan terlihat berwarna ungu setelah penghilangan
warna dan pewarnaan ulang. Kedua uji tersebut harus menggunakan apusan bakteri
atau olesan bakteri agar dapat mencegah kontaminasi kultur.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Bassiri, E., nd. Staining of Bacterial Cells. [Online] Available at:

<https://www.sas.upenn.edu/labmanuals/biol123/Table_of_Contents_files/7-Staining.
pdf> [Accessed 21 Maret 2021]
Cappuccino, J. C., Sherman, N. 2014. Microbiology-A laboratory Manual. 10th Ed., Pearson
Education.
Granato, P., Morton, V. and Morello, J., 2019. Laboratory manual and workbook in
microbiology. 12th ed. New York: McGraw-Hill Education.
Leboffe, M. and Pierce, B., 2010. Microbiology. 3rd ed. Englewood, Colorado: Morton.
Liyana, N. and Kusuma, S. A. F., 2017. REVIEW: DETEKSI Listeria monocytogenes
DALAM MAKANAN. Farmaka, 15 (1)
Napitupulu, R., 2018. Bakteri Gram Positif Dan Bakteri Gram Negatif. [online] Available at:
http://www.pusdik.kkp.go.id/elearning/index.php/modul/read/181219-014108bakteri-c-gram-
c-positif-c-dan-c-bakteri-c-gram-c-negatif [Accessed 23 March 2021]
Petersen, J. a. (2016). Laboratory Exercises in Microbiology: Discovering the Unseen World
Through Hands-On Investigation. CUNY Academic Works. Retrieved from
<http://academicworks.cuny.edu/qb_oers/16>
Pollack, R. A., 2009. Laboratory Exercise In Microbiology. 3rd ed. United States of America:
JOHN WILEY & SONS, INC.
Pommerville, J. C., 2018. Laboratory Fundamentals of Microbiology. 11ed., Jones and
Bartlett Learning.
Sizar, O. and Unakal, C., 2021. Gram Positive Bacteria. [online] Ncbi.nlm.nih.gov. Available
at: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470553/?report=printable> [Accessed 24
March 2021].
Tortora, G., Funke, B. and Case, C., 2019. Microbiology. 13th ed. United States: Pearson
Education.

26