LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

“PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI ALAT SERTA ISOLASI

MIKROBA”

D
I
S
U
S
U
N
OLEH:
WIEDYA ALFITRYA ZAMRI 2001088
TANGGAL PRAKTIKUM : 30 SEPTEMBER 2021
DOSEN : Musyirna Rahmah Nasution M.Si
ASISTEN DOSEN :

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU
YAYASAN UNIV RIAU
2021
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Tinjauan Pustaka
Dalam bidang mikrobiologi harus ada peralatan dan bahan yang dalam keadaan steril.
Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang
mengganggu atau merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang
dikerjakan (Waluyo, 2010). 
Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat
maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau
bahan bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetative maupun spora. Untuk itusebagai
pemula dalam Mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media
serta teknik penanaman (Dwidjoseputro, 1994).
Sterilisasi dalam Mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua
mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang
umumnya dipakai dalam kegiatan sterilisasi yang akan digunakan yaitu penggunaan
panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan
bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban maka
disebut sterilisasi kering (Dwidjoseputro, 1994).
Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat
yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakan harus dalam
keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikrobalain yang tidak diharapkan agar mikroba
dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat
tertentu yang diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara
yangdiperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudiansusunan
makanannya, tekanan osmosis, derajat, keasaman (pH), dantemperatur (Hadietomo, 1990).
Isolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tetsebut dari lingkungannya di
alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi
harus diketahuicara-cara menanam dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta
syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya. Pada pemindahkan bakteri dari medium
lama kedalam medium yang baru yang dapat diperlukan ketelitian dan pengsterilan alat-
alat yang digunakan,supaya dapat terjadinya kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawn 
petri setelah agar baru, maka cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk
 menghindari adanya tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri
(Alam dkk. 2013).
Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolasi dilakukan dengan cara mengambil
sampel mikroba dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian
dikultur(dibiakan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung
tujuan yang ingin dicapai.Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis mikroorganisme
tertentu maka dilakukan isolasi.Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal
dari pembelahan dari satu sel tunggal. Kultur murni atau biakan murni sangat berguna
didalam mikrobiologi,yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme,
termasuk penelaahan ciri-ciri kultural,morfologis,fisiologis,maupun serologis, memerlukan
suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.Sebelum mengisolasi,
harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan sampel dan
media apa yang akan digunakan.
Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila
dibandingkan yang diisolasi dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba
relatif lebih mudah ditumbuhkan, kedepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi
sel lebih mudah ditingkatkan bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya
relatif rendah,kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan
waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Torben,2007).

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut :
1. Pembuatan media dan sterilisasi alat
2. Mengetahui apa itu sterilitas
3. Mengetahui apa saja macam-macam sterilitas
4. Mengetahui bagaimana cara mensterilkan alat
5. Mengetahui apa itu medium
6. Mengetahui apa saja klasifikasi medium

1. Isolasi Mikroba
1. Mengetahui cara dan teknik isolasi mikroba dari makanan, minuman , jamu dan
sampel eksudat bagian tubuh
2. Mengetahui dan memahami metode gores dan tuang
1.3 Teori Kepustakaan
A. Medium
Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan(nutrien)
yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan mikroorganisme.
Mikroorganisme juga merupakan mahluk hidup, untuk memeliharanya dibutuhkan
medium yang harus mengandung semua zat yangdiperlukan untuk pertumbuhannya,
yaitu antara lain senyawa-senyawaorganik (protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan
vitamin). Medium digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan mikroorganisme
apakah bersifat motil atau non motil , medium ini ditambahkan bahan pemadat 50%
(Hadietomo, 1990).
Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangunsel, dan
sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yangmenghasilkan energi).
Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukanterdiri dari air, sumber energi, sumber
karbon, sumber aseptor elektron,sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen.
Selain itu, secara umumnutrien dalam media pembenihan harus mengandung seluruh
elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Hadietomo, 1990).
Menurut Pelgzar (1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya digolongkan
menjadi 7 golongan, yaitu:
1. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan menstimulasi
pertumbuhan mikroba secara umum. Contoh Nutrient Agar (NA) untuk menstimulasi
pertumbuhan bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) untuk menstimulir pertumbuhan
fungi.
2. Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba
dan  kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu
misalnya, medium tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.
3. Media diperkaya (enrichment media), media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu
untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk
menstimulasi pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran
berbagai mikroba, contoh Chocolate media dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.
4. Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan
menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu
spesimen. Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik, garam dan bahan-bahan kimia
lainnya.
 5. Media diferensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau
reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh memperlihatkan
perubahan-perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.
6. Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susunan tertentu yang
digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan bantuan bakteri
misalnya medium untuk menguji vitamin-vitamin, antibiotika dan lain-lain.
7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan, misalnya medium untuk menghitung
jumlah bakteri E.coli air sumur.

b. Sterilisasi
Sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan khususnya mikroba dalam
suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu
proses untuk mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu
benda. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,
penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-
sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban maka disebut
sterilisasi kering (dwidjoseputro, 1994).
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri
masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung
sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan
mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hatowo, 1992).
Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara
sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium Mikrobiologi ialah dengan
pemanasan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi
panas lembab, bila tanpa kelembaban disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi
kering (Ammi, dkk., 2013).
Keadaan steril adalah kondisi mutlak yang tercipta sebagai akibat penghancuran dan
penghilangan semua mikroorganisme hidup. Selain itu, steril dapat didefenisikan sebagai
sesuatu suatu pengertian yang absolut dan itu berarti bahwa 100 % bebas dari
mikroorganisme. Namun penertian ini kadang-kadang membawa dilema,mengingat
ketidaksempurnaan teknik yang dimiliki dalam proses pembuatan. Jumlah contoh yang
diamati, untuk dianalisis serta metode analisa yang tidak sempurna.
 Menurut pendapat beberapa ahli terdapat berbagai macam-macam proses sterilisasi
dalam praktikum mikrobiologi. Macam-macam sterilisasi yang dapat digunakan adalah
sebagai berikut:
1.   Sterilisasi Secara Mekanik (Fitrasi)
Sterilisasi Mekanik adalah sterilisasi bahan yang tidak tahan panas, seperti
misalnya ekstrak tanaman, media sintetik tertentu, dan antibiotik dilakukan dengan
penyaringan. Dasar metode ini semata - mata ialah proses mekanis yang
membersihkan larutan atau suspensi dari segala organisme hidup dengan
melewatkannya pada suatu saringan, misalnya menggunakan saringan Seitz
(Elektromedik, 2011).
Didalam sterilisasi secara mekanik (fitrasi) yang menggunakan suatu saringan
yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikron) sehingga mikroba tertahan
pada saringan tersebut. Proses ini dapat ditunjukkan untuk sterilisasi bahan yang peka
panas, misalnya larutan enzim atau antibiotik. Jika terdapat beberapa bahan yang
akibat pemanasan tinggi atau bertekanan tinggi akan mengalami perubahan atau
penguraian, maka dari itu sterilisasi yang digunakan adalah dengan cara mekanik,
misalnya saringan (Pratiwi, 2008).
2.   Sterilisasi Secara Fisik
Sterilisasi secara fisik dapat digunakan dengan cara pemanasan atau penyinaran.
Terdapat berbagai macam sterilisasi dengan pemanasan yang diantaranya adalah
sebagai berikut:
a. Pemijaran Api
Terdapat berbagai macam pemijaran, maksud ini dipakai muffle, yang
biasanya mencapai suhu 1.000° C. Bila ingin diketahui beratnya, maka krus
porselen yang dipakai, didinginkan sampai kira-kira 100° C, lalu didinginkan
kedalam eksikator, dan akhirnya ditimbang (Sudarmadji dkk, 2007).
b. Panas Kering
Sterilisasi panas kering adalah proses sterilisasi dengan udara panas. Pada
sterilisasi dengan panas kering atau udara panas dianjurkan apabila pada
penggunaan uap bertekanan dengan benda yang disterilkan. Hal ini dapat berlaku
bagi perabotan laboratorium seperti cawan petri, pipet, minyak, serbuk serta juga
beberapa pada peralatan. Benda-benda tersebut disterilkan dalam oven listrik atau
gas, untuk dapat mensterilkan pada perabotan pecah belah di laboratorium
dibutuhkan suhu 160° C selama 2 jam (Pelezar, 1988).
 c. Panas Lembab (Uap Bertekanan)
Panas dalam bentuk uap jenuh bertekanan adalah sarana yang paling
praktis dan juga dapat diandalkan untuk sterilisasi. Uap bertekanan yang dapat
menyediakan suhu jauh di atas titik didih. Disamping itu juga mempunyai
keuntungan seperti pemanasan dapat berlangsung cepat, mempunyai daya tembus,
dan menghasilkan kelembapan yang tinggi, kesemuanya ini dapat mempermudah
koagulasi protei sel-sel mikroba (Pelezar, 1988).
3.    Sterilisasi Secara Kimiawi
Sterilisasi secara kimiawi biasanya digunakan pada alat ataupun bahan
yang tidak tahan panas atau untuk kondisi aseptis (sterilisasi meja kerja dan tangan).
Bahan kimia yang dapat digunakan adalah alkohol, asam parasetat, formaldehid dan
lain-lainnya (Pratiwi 2008).
Sterilisasi Secara Kimia, dapat dilakukan dengan cara Sterilisasi Gas
digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan
sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat,
sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan
dibunuh. Gas yang biasa digunakan adalah etilen oksida dalam bentuk murni atau
campuran dengan gas inert lainnya. Gas ini sangat mudah menguap dan sangat mudah
terbakar. Merupakan agen alkilasi yang menyebabkan dekstruksi 10 mikroorganisme
termasuk sel-sel spora dan vegetatif.
Sterilisasi dilakukan dalam ruang atau chamber sterilisasi. Faktor-faktor
yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan
distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada
adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan
pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain
khusus pada bahan pengemas (Hadada, A W, 2009).
4.    Sterilisasi Secara Radiasi
Menurut pendapat Pratiwi (2008), sterilisasi radiasi dapat dilakukan
dengan menggunakan radiasi sebagai berikut:
a.   Ultraviolet
Ultraviolet merupakan gelombang elektromagnetik dengan panjang
gelombang 100-400 mm dengan efek optimal pada 254 mm. Sumbernya adalah
lampu uap merkuri dengan daya tembus hanya 0,01-0,2 mm. Ultraviolet
digunakan untuk sterilisasi ruangan pada penggunaan aseptik.
 b.   Ion
Mekanisme mengikutori pada tumbukan yaitu adalah sinar langsung
menghantarkan pusat kehidupan mikroba (kromosom) atau secara tidak langsung
dengan sinar terlebih dulu yang membentuk molekul dan juga mengubahnya
menjadi pada bentuk radikatnya yang dapat menyebabkan terjadinya reaksi
sekunder pada bagian molekul DNA mikroba.
c.   Gamma
Gamma bersumber dari CO6O dan  C5137 dengan aktifitas sebesar 50-500
kilo curie serta memiliki suatu daya tembus sangat tinggi. Dosis pada
efektifitasnya adalah 2,5 Mrad. Gamma juga digunakan untuk dapat mensterilkan
alat-alat yang terbuat dari logam, karet serta bahan sintesis seperti pada
polietilen.

C. Isolasi Mikroba
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya
dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap
pada tempatnya.
Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme
(bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi lebih
dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika
hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu
sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis (Alam dkk, 2013).
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainyang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini
dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba
akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya(Indriyani, 2007).
Ada empat metodemengisolasi bakteri yaitu :
a. Pour plateatau metode tuang
Beberapa ml bakteri dicampur dengan medium yang masih
cair.Setelah inkubasi padasuhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada
permukaan dan bagian bawah agar.
 b. Streak plate atau metode gores
Kawat ose mengandungbakteri digoreskan permukaan agar-agar dalam
cawan petri sebanyak tiga baris.metode ini membutuhkan keterampilan
karena jika salah menggoreskan jarum ose akan mengakibatkan medium agar
tergores.
c. Slant culture atau agar miring
Kawat ose yang mengandung bakteri digoreskan pada permukaan
agarmiring dalam tabung reaksi. Penggoresan dilakukan dengan cara
menggoreskan secara zig-zag pada permukaan agar miring.d.Stab
cultureatau agar tegakKawat ose yang mengandungbakteri ditusukkan
pada media kira-kira ¾ bagian agardalam tabung reaksi. Cara ini
digunakan untuk menguji bakteri yang bersifat anerob atau tidak
memerlukan oksigen. (Afriyanto, 2004)
1.4 Alat dan Bahan Serta Prosedur Kerja
Cara Mensterilkan Alat
Peralatan harus dibungkus sebelum disterilisasikan agar ketika sudah selesai di
sterilisasi dan dikeluarkan dari autoclave, maka peralatan tersebut masih steril dan
tetap terjaga.
Alat :
1. Cawan
2. Tabung reaksi
3. Erlenmeyer
4. Pipet seukuran
Cara membungkus alat yang akan disterilisasikan
Cawan petri
1. Gunakan kertas bekas yang bersih dan bagian yang bersih berada didalam.
2. Cawan kecil berada diatas dan cawan yang besar berada dibawah. Posisikan
ditengah, lalu dibungkus hingga rapat dan dirapikan.Pipet seukuran
3. Gunakan kertas bekas yang bersih kemudian potong menjadi 4 bagian Ujung
pipet ditutup dengan kapas berlemak.
4. Bagian kertas yang bersih berada didalam, lalu bungkus dengan cara diputar dan
digulung sampai semua bagian terbungkus. Agar tidak terlepas, gunakan tali
secukupnya untuk mengikat kertas.
 Tabung rekasi dan erlenmeyer
1. Kasa diletakkan diatas tabung reaksiatau erlenmeyer. Lalu masukkan kapas
berlemak kedalamnya, pastikan padat dan tidak longgar.
2. Lalu diikat, agar tidak terlepas.
3. Sisa kain kasa kemudian dipotong.
Sterilisasi yang digunakan terdiri dari dua macam yaitu sterilisasi basah dan
strerilisasi kering. Sterlisasi basah menggunakan uap air panas bertekanan (autoclave)
dan sterilisasi kering menggunakan oven kering. Sterilisasi basah digunakan untuk
mensterilkan media, sedangkan sterilisasi kering digunakan untuk mensterilisasi alat
seperti sectio set, tabung reaksi ulir dan kapas serta cawan petri.

1. Sterilisasi basah
Autoclave adalah alat pemanas tertutup yang fungsinya untuk mensterilkan suatu
benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi biasanya suhu yang digunakan
121°C dan bertekanan 15 kg/cm2 yang dilakukan selama kurang lebih 15 menit.
1. Buka tutup autoclave, letakkan diatas meja dan pastikan pipa untuk uap keluar tidak
tertekuk.
2. Keluarkan wadah yang terdapat didalam autoclave, dan masukkan media ke wadah
tersebut.
3. Autoclave diisi dengar air sampai batas lalu letakkan wadah ke dalam autoclave.
4. Beri vaseline dibagian tepi autoclave dan tepi tutup autoclave. Tujuannya untuk
memudahkan membuka autoclave ketika selesai digunakan.
5. Setelah diberi vaseline tutup autoclave dan pastikan pipa yang digunakan untuk
mengeluarkan uap diletakkan ditempat yang benar.
6. Pastikan tanda panah pada tutup autoclave sejajar dengan tanda panah pada wadah
autoclave.
7. Pastikan rongga antar tutup sejajar, setelah itu tutup rapat autoclave dengan sekrup.
8. Setelah itu, katup diberdirikan dan autoclave diletakkan diatas kompor.
9. Setelah uap air keluar katup ditutup, ketika katup ditutup jarum manometer akan
naik menuju angka 15 yang artinya tekanan yang berada di dalam autoclave telah
mencapai 15 pound dengan suhu yang berkisar 121°C dan waktu 15 menit.
10. Setelah 15 menit, katup diberdikirikan atau dibuka lalu tutup autoclave bisa dibuka.
Untuk megeluarkan alat dan bahan yang telah steril.
 Tekanan harus 15 pounds dan suhu berkisar 121°C berfungsi untuk membunuh
mikroba kontaminan yang ada pada media yang telah dibuat.
2. Sterilisasi Kering
1. Buka oven kering.
2. Masukkan alat yang akan sterilkan kemudian tutup oven.
3. Putar tombol ke angka 1 dan lampu kuning akan menyala. Setelah 10 menit lampu
hijau akan menyala. Ketika lampu hijau menyala, putar timer ke angka 2 yang
mengartikan bahwa sterilisasi akan berlangsung selama 2 jam.
4. Setelah itu, putar termostart diputar kearah kanan. Proses sterilisasi kering akan
berlangsung dengan suhu 120-150°C selama 2 jam
5. Setelah 2 jam, oven kering akan mati dengan sendirinya. Putar tombol termostart ke
angka nol dan sterilisasi kering selesai dilakukan.

Pembuatan media
Alat : Bahan :
- Gelas ukur - Aquadest
- Timbangan analitik - Agar
- Erlenmeyer - Alkohol
- Kapas - Potato Dextose Agar
- Kertas sampul
- Autoclave
- Lampu spiritus
- Petridish
- Hotplate
- Corong
- Pengaduk
- Shield

Cara kerja :
a. Medium Nutrient Agar (NA)
1. Aquadest dituang kedalam gelas ukur hingga volumenya mencapai 100 ml
2. Aquadest dituangkan kedalam Erlenmeyer sebelum nutrient broth dibubuhkan. Agar
nutrient broth tidak menempel ke Erlenmeyer.
 3. Lalu diaduk, dan dipanaskan hingga homogen.
4. Nutrient broth didalam tabung Erlenmeyer ditambahkan agar. Dan medium
dipanaskan kembali.
5. Erlenmeyer disumbat menggunakan kapas lalu dibungkus dengan kertas sampul.
6. Medium disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121°C. Dengan tekanan 2
atmosfer.
7. Sebelum bekerja, dilakukan sterilisasi lingkungan kerja.
8. Hidupkan lampu spiritus.
9. Medium di tuang ke petridish yang sudah disterilkan.
10. Petridish di shield dan dilapisi dengan kertas sampul.
11. Medium yang telah dibuat bisa digunakan untuk memperbanyak mikroba.

b. Medium Potato Dextose Agar (PDA)

1. Media ditimbang dan dimasukkan ke dalam wadah beaker glass/ Erlenmeyer
dan dilarutkan dalam aquades.
2. Wadah yang berisi media tersebut di panaskan diatas hotplate sambil sekali-
sekali diaduk.
3. Media akan mendidih dan berwarna kuning keemasan
4. Media yang telah mendidih diangkat dari atas hotplate dan didinginkan, dan
ditutup
5. Media disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.

Isolasi Mikroba
a. Alat
1. Lampu spiritus / Bunsen
2. Cawan Petri steril
3. Jarum Ose
b. Bahan
1. Media NA dan PDA
2. Sampel pangan. Plak gigi, eksudat bagian tubuh (air ludah, sputum)
3. Aquades steril dalam tabung reaksi

Cara Kerja
a. Penyiapan Plat Agar
 1. Media NA steril dipanaskan sampai mencair seluruhnya. Lalu didinginkan
hingga suhu 40˚C- 50˚C, dimasukkan 10 ml ke dalam tabung reaksi. Tabung
reaksi dimiringkan hingga media mengeras
2. Media NA tersebut juga dituangkan kedalam cawan Petri steril secara aseptis.
3. Putar cawan Petri pelan-pelan hingga media tersebar merata dan diamkan hingga
membeku.

b. Penyiapan sampel
1. Sampel pangan, eksudat bagian tubuh diambil 1 ml dimasukkan kedalam tabung
reaksi yang telah berisi aquades 9 ml. Sampel dihomogenkan.
2. Lakukan pengenceran bertingkat 10-1 hingga 10-4
c. Metode Gores (Streak plate)
1. Siapkan media NA pada cawan Petri, beri label/penanda
2. Panaskan jarum Ose hingga berpijar
3. Buka tutup tabung sampel cair, ambillah sampel yang mengandung campuran
bakteri tersebut menggunakan ujung jarum Ose yang bulat.
4. Goreskan (4 goresan) sampel yang mengandung campuran bakteri dari jarum
Ose tersebut pada salah satu tepi permukaan media pada cawan Petri secara
aseptis.
5. Gesek goresan yang pertama tadi menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan
ke arah tegak lurus dari goresan sebelumnya. Pijarkan kembali jarum Ose.
6. Lakukan goresan yang sama dari hasil goresan yang baru tersebut ke arah tegak
lurus yang baru. Ujung jarum tidak boleh menyentuh daerah inokulasi pertama.
7. Dengan cara yang sama buat goresan ke 4 sehingga terbentuk 16 garis inokulasi
mengelilingi cawan petri.
8. Inkubasi pada suhu ruang selama 18-24 jam
9. Amati pertumbuhan koloni bakteri yang terjadi pada masing-masing daerah
inokulasi.

d. Metoda Tuang (Pourplate methode)

1. Cairkan media NA steril, diamkan hingga suhu 40˚C – 50˚C.
2. Ambil 1 ml masing-masing pengenceran 10-2 dan 10-4 dari sampel.
3. Masukkan ke dalam cawan Steril
 4. Tuangkan media NA yang telah dicairkan ke dalam cawan Petri itu. Putar Petri
perlahan agar media tercampur rata dengan suspensi bakteri.
5. Inkubasi pada suhu ruang selama 18-24 jam.
e. Metode Sebar (Spread plate method)
1. Larutan diambil sebanyak 0,1 ml secara aseptis dengan mikropipet
2. Dituang pada medium agar petri
3. Larutan kemudian diratakan dengan trigalski secara searah
4. Diinkubasi pada suhu 37˚C selama 48 j
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Pembuatan Media NA Dan PDA

Percobaan kali ini mengenai sterilisasi dan pembuatan media untuk mikroba,
tujuannya adalah untuk menciptakan sebuah medium yang steril dan membuat makanan
untuk mikroba. Percobaan dibagi menjadi 3.
Percobaan pertama adalah sterilisasi. Pada percobaan sterilisasi, labu erlenmeyer dan
cawan petri pada awalnya dicuci dengan sabun cuci untuk membunuh mikroba dengan cara
kimia, kemudian dibilas dengan aquadest. Setelah dikeringkan, labu erlenmeyer dan cawan
petri kemudian dibungkus dengan aluminium foil untuk isolasi termal (penghalang dan
reflektifitas), jadi panasnya tidak akan keluar dari dalam labu erlenmeyer maupun cawan
petri yang ingin disterilkan.
1. Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Percobaan kedua adalah pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA). Medium

PDA (Potato Dekstrosa Agar) berdasarkan susunannya merupakan medium organik
semi alamiah atau semi sintetis sebab terdiri dari bahan alamiah yang ditambah
dengan senyawa kimia; berdasarkan konsistensinya merupakan medium padat karena
mengandung agar yang memadatkan medium berdasarkan kegunaannya merupakan
medium untuk pertumbuhan jamur.
Medium PDA terdiri dari kentang yang berfungsi sebagai sumber energi,
nitrogen organik, karbon dan vitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai
bahan pemadat medium dan aquadest sebagai pelarut untuk menghomogenkan
medium dan sumber O2.
Dimana PDA ini digunakan untuk menumbuhkan fungi atau jamur. Dalam
pembuatan PDA, setiap proses nya harus steril, bertujuan agar PDA yang di buat
tidak ditumbuhi mikroorganisme lain yang dapat menghambat pertumbuhan jamur
atau fungi. Pembuatan media PDA ini dengan menimbang PDA lalu dimasukkan ke
dalam wadah beaker glass/ Erlenmeyer dan dilarutkan dalam aquadest, kemudian
diaduk, panaskan hingga mendidih, setelah medidih, tutup erlenmeyer dengan
penyumbat yang sudah dibuat tadi. Bungkus erlenmeyer inin dengan kertas koran,
kemudian sterilkan menggunakan autoclave, lalu dinginkan, masukkan kedalam
kulkas untuk disimpan.
Semua media dipanaskan hingga mendidih, tujuan nya untuk mematikan
organisme atau mengkoorganisme yang ada atau hidup pada pelarut (aquadest) dan
zat terlarutnya. Semua media disimpan dalam kulkas, tujuan nya untuk media
tersebut menjadi awet dan tidk ditumbuhi mikroorganisme lain yang tidak
diinginkan. Suhu yang rendah dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme
tersebut.
Semua peralatan kaca disterilkan, karen pada saat mengembangbiakkan
bakteri, harus dalam keadaan yang aseptis (steril). Peralatan yang steril juga mampu
menghambat pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan. Tujuan dipakaikan
penyumbat pada masing-masing alat adalah untuk mencegah masuknya atau
kontaminasi zat atau mikroorganisme lain yang tidak diinginkan.
2. Media NA (Nutrient Agar)

Percobaan ketiga adalah pembuatan Nutrient Agar (NA). Dimana NA ini

dibuat dengan komposisi agar-agar yang sudah dipadatkan sehingga NA juga bisa
disebutnutrient padat yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri. NA dibuat dari
campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat.
Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang
mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga
tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan pepton
digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin
serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan
berkembang.
Medium Nutrient Agar (NA) merupakan medium yang berwarna coklat
muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik
dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri. NA
ditimbang sebanyak lalu dilarutkan dengan aquadest dalam erlenmeyer. Lalu diaduk
dan dipanaskan sampai mendidih di hote plate hingga media bewarna kekuningan.
Setelah itu didinginkan. Tutup erlenmeyer dengan penyumbat yang sudah dibuat
sebelumnya. Setelah ditutup, erlenmeyer dibungkus menggunakan kertas koran, dan
diikat menggunakan benang. Setelah didinginkan erlenmeyer yang berisi media ini
disterilkan menggunakan autoclave, tunggu hingga dingin. Masukkan kedalam
kulkas untuk disimpan.
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi kesalahan pada saat praktikum adalah :
a. Alat yang digunakan tidak steril
b. Bahan yang digunakan sudah terkontaminasi dengan zat yang lain
c. Kurangnya ketelitian praktikan pada saat melakukan percobaan baik pada saat penimbangan
maupun pada saat titrasi
d. Kurang teliti pada saat membaca volume titrasi

Autoclave adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi

suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121°C, 15 lbs) selama kurang
lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh
mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang
akan membunuh mikroorganisme.
Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang
diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada
spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh
sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100°C, yang merupakan
titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121°C, endospora dapat dibunuh
dalam waktu 4 — 5 menit, di mana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6
— 30 detik pada suhu 65°C.
Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf
mencapai 121°C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada
bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total
untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121°C untuk waktu 10 — 15 menit.
Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan
diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai
suhu sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indikator biologi, contohnya Bacillus
stearothermophilus. Terdapat tiga jenis autoklaf, yaitu gravity displacement, prevacuum atau
high vacuum, dan steam-flush pressure-pulse. Perbedaan ketiga jenis autoklaf ini terletak pada
bagaimana udara dihilangkan dari dalam autoklaf selama proses sterilisasi.
Prinsip Cara Kerja Autoclave
 Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoclave lama kelamaan akan mendidih.
 Uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoclave.
 Setelah udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup udara/uap ditutup sehingga
tekanan udara dalam autoclave naik.
 Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer
mulai menghitung waktu mundur.
 Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun
perlahan hingga mencapai suhu 0°C.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah:
 Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
 Pelarut organik, seperti fenol
 Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi antara lain:

1. Kelembaban
2. Konsentrasi gas
3. Suhu
4. Distribusi gas dalam chamber pengsterilan
Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan
pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus
dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.
Isolasi Mikroba
Dalam praktikum isolasi bakteri, diperlukan medium yang berisi zat hara untuk
metabolisme sel, sintesis sel dan pertumbuhan sel. Yang digunakan dalam praktikum
adalah medium padat yaitu agar. Media yang digunakan dalam praktikum adalah NA
karena yang akan di biakan adalah bakteri.Metode yang dilakukan antara lain :
1. Metode tuang (pour plate)
 Metode tuang terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam hal ini digunakan
bakteri dari udara, air sumur, air sungai tanah dan makananyang sudah dibuat dalam acara 1
dengan medium NA dalam cawan petri. Akuades dituang ditengah cawan, lalu diambil 1
ose bakteri dan dicampurkan dengan akuades yangadaditengah cawan. Selanjutnya
dituangkan media ke dalam cawan petri, media yangdigunakan yaitu NA pada suhu 45 oC–
50 0C.
Cawan ini kemudian diputar untuk mencampur isinya dan dibiarkan memadat.
Setelah memadat, diinkubasi selama 2 hari dan terlihatlah koloni yang adapada media
tersebut.Tujannya adalah memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain sehingga terbentuk
menjadi koloni-koloni yang terpisah dalam medium yang padat.
Pada percobaan isolasi bakteri dengan menggunakan teknik pour plate bentuk
kolonibakterimenyebar tidak teratur. Bakteri yang ada pada mediumbentuknya tidak beraturan,
ukurannya titik dan ada beberapa yang berukuran kecil.Kenampakan bentuknya datar atau
flat, dan bagian tepi koloni seperti terdapat filamen.
2. Metode goresan (streak plate)

Metode goresan terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam hal ini
digunakan bakteri dari udara, air sumur, air sungai tanah dan makananyang sudah dibuat
 dalam acara 1 dengan medium NAdalam cawan petri.Medium NA dengan suhu 450C –
500C dituangkan kedalamcawanpetri sterildan diratakanselanjutnyadibiarkan dingin dan
memadat. Setelah medium NA padat, ambil 1 ose bakteri pada acara 1 kemudian
goreskan pada permukaan agar. Cara menggoreskannya yaitu cawan dibagi menjadi 4
bagian kemudian goreskan bakteri pada permukaan agar tiga baris yangmenyambung dari
cawan kuadranke-1 sampai ke cawan kuadranke-4. Setelah diinkubasi selama 2 hari
akan terlihat koloni bakteri berkumpul pada goresan-goresan tersebut.
Seharusnya pada kuadran ke-1 terdapat mikroba dalam jumlah yang penuh
kemudian semakin berkurang pada setiap kuadrannya, dan seharusnya pada kuadran
ke-4 mampu diamati koloni mikrobanya. Dikarenakan pada saat penggoresan yang
kurang baik, atau terjadinya kontaminasi sehinggabakteri menyebar ke semua bagian
cawan. Bakteri yang dihasilkan ada bermacam-macam ukuran ada yang besar dan kecil,
bentuk koloni bakteri tidak beraturan, kenampakan bentuk koloni datardan bagian tepi
koloni tidak rata dan cenderung bergelombang.
3.Agar miring (slant culture)

Metode ini mirip dengan metode streak plate, hanya saja metode slant culture
ini (agar miring) media NA disiapkan dalam tabung reaksi dengan posisimiring. Satu
osebakteri diambil dari acara I dan digoreskan dengan arah zig-zag dimulai dari bawah
tabung. Setelah itu diinkubasi selama 2 X 24 jam untuk melihat pertumbuhan bakteri.
Dalam percobaan yang dilakukan ada pertumbuhan bakteri yang terlihat di permukaan agar.
Bakteri yang tumbuh disekitar goresan berukuran titik dan kecil.
Bakteri yang tumbuh bersifat aerob.4.Agar tegak (stab culture) Medium NA
disiapkan dalam tabung reaksi, kemudian 1 ose koloni bakteri diambil dari acara I dan
ditusukkan dengan menggunakan jarum ose yang ujungnya runcing. Setelah itu tabung
ditutup menggunakan kapas dan plastik dan diinkubasi selama 2 hari. Setelah 2 hari
inkubasi terdapat pertumbuhan mikroba pada agar ditusukkan sebelumnya. Bakteri yang
tumbuh memiliki bentuk seperti gelembungdan bakteri yang tumbuh bersifat anaerob.
Pada metode stabculture ini teerjadi kontaminasi dengan mikro organisme lain yang
menyebabkan permukaan agar tegak menjadi berwarna hijau kebiru-biruan.
 BAB IV
KESIMPULAN

Kesimpulan pada percobaan yang telah kita lakuka adalah sebagaii berikut :
1. Proses mematikan semua mikroorganisme yang hidup namun tidak dibutuhkan atau
menjadi parasite bagi suatu kegiatan dinamakan dengan strerilisasi
3. Cara sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium Mikrobiologi
ialah dengan pemanasan.
4. Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (zat makanan) yang
dipakai untuk menumbuhkan mikroba atau bakteri patogen tanaman.
5. Ada beberapa cara untuk Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara fisik, kimia, radiasi
dan filter.
6. Autoclave adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu
benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121°C, 15 lbs) selama
kurang lebih 15 menit.
7. NA Dan PDA merupakan media yang digunakan pada praktikum ini
8. Metode yang di gunakan metode Streak Plate, metode pourplate, metode spreadplate.
9. Faktor yang mempengaruhi yaitu suplai nutrisi, suhu, kebersihan.
10. Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikrooorganisme di
luar dari lingkungan alaminya
11. Prinsip dari isolasi mikoba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mokroba
lainnya yng berasal dari campuran bermacam-macam mikroba
 DAFTAR PUSTAKA

Indriyani,Nur dan Asnani, 2007,Penuntun Praktikum Mikrobiologi Akuatik, Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan, Unhalu : Kendari.
Dwidjoseputro, D. 1985. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang: Penerbit Djambatan.
Hadioetomo, RS, 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.
Gramedis:jakarta
Lay dan Hatowo, 1992, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Pertanian Desa Bayat, Klaten, Jawa Tengah. Chem Info. No.1(1) : 190-195.
Anonim. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Indonesia: Jakarta.
Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya: Bandung.
Schlegel Hans G,. 1994. Mikrobiologi Umum. Penterjemah Tedjo Baskoro. Edisi keenam. Gajah
Mada University Press. Yogyakarta
Subaghdja, Rickie, 2010, Sterilisasi dan Pengenalan Alat Mikrobiologi, Yudistira: Bandung.