MODUL PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI FARMASI

Dosen Penyusun :
apt. Ani Florida Ngete., M.Farm

PRODI S1 FARMASI
2020

Alamat :
Jl. Kapten Mulyadi No.17, Karanganyar
Jl. Solo-Kebakkramat No.11, Kemiri, Karanganyar
No.Telepon : 0271- 6491717, No.Fax : 0271-495919
 IDENTITAS MAHASISWA

NAMA : ……………………………………………………………………..

LENGKAP

NIM : ……………………………………………………………………..

TINGKAT/ : ……………………………………………………………………..

SEMESTER

HP/ TELP : ……………………………………………………………………..

ii
 PERSETUJUAN MODUL PRAKTIKUM

Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi Prodi S1 Farmasi STIKES Tujuh Belas

Tahun Akademik 2019/2020 Telah disetujui oleh :

Karanganyar, 06 Januari 2020

Kaprodi S1 Farmasi
STIKES Tujuh Belas

apt.Agus Gunawan., M.Farm

Wakil Ketua I Bidang Akademik

STIKES Tujuh Belas

Saka Suminar, S.Kep., M.Kes

iii
 VISI, MISI DAN TUJUAN

Visi Program Studi S1 Farmasi

Menghasilkan insan kesehatan di bidang Farmasi yang kompeten dan kompetitif
pada tahun 2025

Misi Program Studi S1 Farmasi

1. Menyelenggarakan pendidikan kefarmasian yang bermutu dan berkompeten di
bidang sains, teknologi, farmasi klinis dan komunitas.
2. Menyelenggarakan penelitian kefarmasian yang bermutu terutama dalam bidang
pengembangan bahan alam.
3. Menerapkan ilmu pengetahuan dan teknologi serta hasil - hasil penelitian kepada
masyarakat, industri farmasi dan instansi terkait.
4. Menjalin jaringan kerjasama yang produktif dan berkelanjutan dengan lembaga
penelitian, dunia usaha, instansi pemerintahan, lembaga sosial terkait di tingkat
daerah, nasional dan global.
5. Mengembangkan organisasi dalam meningkatkan kualitas tata kelola yang baik
(good governance), sehingga mampu beradaptasi dengan perubahan
lingkungan strategis.

Tujuan
1. Menghasilkan lulusan berdaya saing global, berintegritas tinggi, berbudi luhur,
berkompeten dan professional yang memiliki spirit kewirausahaan dalam
menjawab berbagai masalah di bidang sains/ teknologi farmasi, farmasi klinis/
komunitas.
2. Mengembangkan dan memanfaatkan IPTEK yang relevan dengan tujuan
pembangunan nasional dan daerah melalui penyelenggaraan program studi,
penelitian terutama kajian pengembangan bahan alam.
3. Meningkatkan pelaksanaan pengabdian kepada masyarakat dalam rangka
transformasi ilmu pengetahuan dan hasil penelitian kepada masyarakat.
4. Memperluas dan meningkatkan jaringan kerjasama yang saling menguntungkan
dengan berbagai lembaga pemerintah/swasta di dalam dan luar negeri.
5. Terciptanya sistem tatakelola yang baik (Good Governance Practice)
khususnya; di bidang perencanaan, tatakelola, evaluasi dan pengembangan
berkelanjutan berasaskan transparansi, akuntabel, akurat dan efisien, dengan
memanfaatkan teknologi sistem informasi.

iv
 KATA PENGANTAR

Buku petunjuk praktikum ini disusun untuk memenuhi kebutuhan

mahasiswa sebagai panduan dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Farmasi,
untuk mahasiswa program studi S1 Farmasi. Dengan adanya buku petunjuk
praktikum ini diharapkan akan membantu dan mempermudah mahasiswa dalam
memahami dan melaksanakan praktikum Mikrobiologi Farmasi, sehingga akan
memperoleh hasil yang baik.
Materi yang dipraktikumkan merupakan materi yang sesuai dengan konsep
teori Mikrobiologi Farmasi dan diharapkan dapat memberikan bekal untuk materi
lanjutannya. Untuk itu dasar teori yang didapatkan saat kuliah juga akan sangat
membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Farmasi ini.
Buku petunjuk ini masih dalam proses penyempurnaan. Insya Alloh
perbaikan akan terus dilakukan demi kesempurnaan buku petunjuk praktikum ini
dan disesuaikan dengan perkembangan ilmu pengetahuan. Semoga buku petunjuk
ini dapat dipergunakan sebagaimana mestinya.

Karanganyar, Januari 2020

Koordinator
Praktik Mikrobiologi Farmasi

v
 KETENTUAN LAPORAN PRAKTIKUM

PENULISAN LAPORAN
Laporan praktikum ditulis tangan dengan tinta hitam menggunakan kertas A4. Margin
halaman ialah kiri 3 cm, atas 3 cm, kanan 2 cm, dan bawah 2 cm.

SISTEMATIKA LAPORAN
Sistematika dalam penulisan laporan praktikum secara berurutan ialah sebagai berikut.
Cover Laporan
Bab I Pendahuluan
1.1 Latar Belakang
1.2 Tujuan Percobaan
Bab II Dasar Teori (minimal 15 halaman)
Bab III Metodologi Percobaan
3.1 Alat yang Digunakan
3.2 Bahan yang Digunakan
3.3 Gambar Alat
3.4 Prosedur Percobaan
Bab IV Analisis Data dan Pembahasan
Bab V Jawaban Pertanyaan (jika ada)
Bab VI Kesimpulan
Daftar Pustaka
Lampiran

vi
 DAFTAR ISI
IDENTITAS MAHASISWA .................................................................................... 2
PERSETUJUAN MODUL PRAKTIKUM ................................................................ 3
VISI, MISI DAN TUJUAN ...................................................................................... 4
KATA PENGANTAR ............................................................................................. 5
KETENTUAN LAPORAN PRAKTIKUM ................................................................ 6
PENULISAN LAPORAN ....................................................................................... 6
SISTEMATIKA LAPORAN .................................................................................... 6
PRAKTIKUM 1 .................................................................................................... 11
Sterilisasi Alat, Bahan dan Media ..................................................................... 11
PENDAHULUAN ................................................................................................. 11
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 11
ALAT DAN BAHAN ............................................................................................ 13
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 13
HASIL PENGAMATAN ....................................................................................... 13
PRAKTIKUM II .................................................................................................... 14
DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI ........................................................ 14
PENDAHULUAN ................................................................................................. 14
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 14
ALAT DAN BAHAN ............................................................................................ 14
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 14
PRAKTIKUM III ................................................................................................... 17
MIC GRAM POSITIF DAN NEGATIF .................................................................. 17
PENDAHULUAN ................................................................................................. 17
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 17
BAHAN DAN ALAT ............................................................................................ 17
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 17
PRAKTIKUM IV ................................................................................................... 20
UJI CEMARAN MIKROBA DAN UJI STERILITAS ............................................. 20
vii
PENDAHULUAN ................................................................................................. 20
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 20
BAHAN DAN ALAT ............................................................................................ 20
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 20
PRAKTIKUM V .................................................................................................... 26
PENDAHULUAN ................................................................................................. 26
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 26
BAHAN DAN ALAT ............................................................................................ 26
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 26
PRAKTIKUM VI ................................................................................................... 31
UJI KEPEKAAN ANTIBIOTIK: PENENTUAN KHM ............................................ 31
PENDAHULUAN ................................................................................................. 31
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 31
ALAT DAN BAHAN ............................................................................................ 31
PROSEDUR PERCOBAAN................................................................................. 31
METODE DILUSI 1. Masukkan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan
dengan sedikit pelarutnya. Kemudian tambahkan air suling steril sampai
tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir,
sebelum dimasukkan dalam labu ukur. 2. Rencanakan pengenceran dan
perhitungan konsentrasi campuran pada masingmasing tabung besar dan
tabung-tabung kecil. 3. Buat pengenceran bertingkat larutan uji dengan air
suling dalam tabung-tabung reaksi besar. 4. Isi tabung reaksi kecil pertama
dengan 1 mL NB Double Strenght, sedangkan tabung-tabung reaksi
selanjutnya dengan 1 mL NB biasa. 5. Pipet 1 mL hasil pengenceran terakhir
ke dalam tabung 1 berisi NB double strength, kocok sampai homogen. 6.
Pipet 1 mL campuran dari tabung 1 ke tabung 2, kocok sampai homogen. 7.
Ulangi langkah tersebut sampai tabung terakhir. Buang 1 mL campuran dari
tabung terakhir. 8. Tambahkan 1 ose bakteri kedalam masing-masing tabung
kecil, kocok sampai homogen. 9. Ulangi langkah 3 sampai 7 untuk bakteri
yang lain. 10. Buat kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif terdiri
dari 1mL NB dan 1 ose bakteri (salah satu saja). Kontrol negatif hanya berisi
1mL NB 11. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 37oC selama 18-24
jam. Amati kekeruhan yang terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan
negatif. 12. Tentukan dimana KHM nya. KHM terletak pada tabung bening
yang terakhir atau sebelum tabung keruh pertama......................................... 31
METODE DIFUSI 1. Masukkan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan
viii
dengan sedikit pelarutnya. Kemudian tambahkan air suling steril sampai
tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir,
sebelum dimasukkan dalam labu ukur. 2. Rencanakan pengenceran dan
hitung konsentrasi campuran pada masing-masing tabung besar dan cawan-
cawan petri. 3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air
suling dalam tabung-tabung reaksi besar. 4. Bagi permukaaan dasar cawan
menjadi area-area sama besar. Beri label nama bakteri yang akan digunakan
pada setiap area. 5. Pipet 1 mL masing-masing pengenceran kedalam cawan-
cawan petri tambahkan 19 mL NA cair bersuhu 40-50oC, goyangkan
beberapa saat, lalu diamkan sampai membeku. 6. Goreskan masing-masing
bakteri pada area yang terpisah dengan menggunakan ose. Buat kontrol
positif yang terjadi dari 20 mL NA dalam cawan petri, yang digoreskan oleh
bakteri-bakteri yang digunakan di area yang terpisah. 7. Inkubasikan semua
cawan petri pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Amati pertumbuhan bakteri
dari koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi koloni-koloni tersebut
dengan kontrol positif. 8. Tentukan dimana KHM-nya. KHM terletak pada
cawan petri terakhir yang tidak tampak koloni bakteri. .................................. 32
HASIL PENGAMATAN ....................................................................................... 33
A. METODE DILUSI ....................................................................................... 33
PENGAMATAN ................................................................................................... 33
TABUNG REAKSI ............................................................................................... 33
1 .......................................................................................................................... 33
2 .......................................................................................................................... 33
3 .......................................................................................................................... 33
4 .......................................................................................................................... 33
5 .......................................................................................................................... 33
6 .......................................................................................................................... 33
7 .......................................................................................................................... 33
n .......................................................................................................................... 33
KEKERUHAN ...................................................................................................... 33
B. METODE DIFUSI ....................................................................................... 33
JENIS BAKTERI ................................................................................................. 33
CAWAN PETRI ................................................................................................... 33
1 .......................................................................................................................... 33
2 .......................................................................................................................... 33
ix
3 .......................................................................................................................... 33
Keterangan : (+) : tidak ada pertumbuhan (-) : ada pertumbuhan .................. 33
PRAKTIKUM VII .................................................................................................. 34
PENENTUAN DAYA HAMBAT SEBAGAI ANTISEPTIK .................................... 34
PENDAHULUAN ................................................................................................. 34
TUJUAN PERCOBAAN ...................................................................................... 34
ALAT DAN BAHAN ............................................................................................ 34
Daftar Pustaka.................................................................................................... 36
ASEAN Countries, 1993, Standard of ASEAN Herbal Medicine, Vol.1, ASEAN
Countries, Jakarta Atlas, R.M., Handbook of Microbiological Media, CRC
Press, Boca Raton, 1993. Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2006.
Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik. Jakarta: Badan Pengawasan
Obat dan Makanan. Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2012. Pedoman
Cara Pembuatan Obat yang Baik. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan
Makanan. Bedwell, J., Kairo, S. K., Behr, M. A. dan Bygraves, J. A. (2001) :
Identification of substrains of BCG vaccine using multiplex PCR, Vaccine,
19, 2146 – 2151. Board, RG., A Modern Introduction to Food Microbiology,
Blackwell Sci.Publ., London, 1983 Buckle, K.A, et.al. (Eds.), Foodborne
Microorganisms of Public Health Significance, 4th ed., AIFST (NSW Branch)
Food Microbiology Group, NSW, 1989. Deacon, J.W., Modern Mycology, 3rd
edition, Blackwell Science Ltd.,1997. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia (1995) : Farmakope Indonesia edisi IV, Jakarta, 10 – 14, 855 – 863.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2009) : Suplemen I Farmakope
Indonesia edisi IV, Jakarta, 1512 – 1519. Farmakope Indonesia edisi IV,
Dep.Kes RI, 1995. ............................................................................................... 36
Frazier WC., et al, Food Microbiology, Tata McGraw Hill, Bombay, 1992.
Gams, W., van der Aa, H.A., van der Plaats-Niterink,A.J., Samson R.A., and
Stalpers J.A., CBS Course of Mycology, Centraalbureau Voor
Schimmelcultures, Delft, 1987. Harmonization Of Asean Cosmetic Methods,
2004, Microbiological Methods for Cosmetics, Thailand Hitchin, A.D. Tony,
T.T. and James, E.M., 1992, Microbiological Methods for cosmetics in
Bacteriological Analyctical Manual, 7th ed, AOAC International, Arlington,
USA. International Organization for Standardization (ISO). 1999.
Classification of Airborne Particulates in Ruang Bersih and Associated
Controlled Environments-Part 1. Geneva: ISO 14644-1. ................................. 36

x
 PRAKTIKUM 1
Sterilisasi Alat, Bahan dan Media

PENDAHULUAN
Sterilisasi merupakan suatu proses menghilangkan mikroorganisme hidup. Proses sterilisasi
umumnya merupakan tahap akhir pengolahan sediaan atau produk yang harus terbebas dari
mikroba. Sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan uap air, panas kering, gas, radiasi ion,
dan dengan cara penyaringan. Sterilisasi dengan cara panas merupakan fungsi dari kombinasi waktu
dan suhu yang digunakan. Bila suhu dinaikkan, waktu yang diperlukan menjadi lebih pendek.
Konstituen penting dari jasad hidup seperti protein dan asam nukleat akan didenaturasi sesuai
dengan kecepatan naiknya suhu di atas 50oC. Sterilisasi panas dan lembab menggunakan uap air
jenuh dengan tekanan merupakan metode sterilisasi pilihan untuk sediaan dengan pembawa air serta
kain kasa untuk bedah. Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121 oC selama 15 menit. Untuk
sterilisasi panas kering digunakan oven dengan suhu 170 oC selama 1 jam.
Cara ini digunakan terutama untuk mensterilkan :
a. Alat gelas - perlu dilakukan pencucian dengan air yang tidak mengandung pirogen.
b. Peralatan porselin dan logam.
c. Minyak dan Lemak - termasuk injeksi dengan pembawa minyak.
d. Sediaan Serbuk - termasuk produk alami seperti talkum, yang mungkin mengandung spora
yang resisten. Pemanasan yang tinggi akan menghancurkan pirogen. Untuk sterilisasi
basah digunakan autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit.
Cara ini digunakan untuk alat dan sediaan berikut :
a. Larutan atau suspensi dengan pembawa air.
b. Kain pembalut untuk bedah. Dianjurkan dilakukan pada suhu 134 oC selama 3 menit.
c. Penutup dari karet ataupPlastik. Bila disterilkan terpisah dari wadahnya.
d. Instrumen dari logam. Pemanasan segera diperlukan untuk melindungi terjadinya
engkaratan.
e. Aparatus dari Gelas dan Wadahnya. Bila tidak dapat dengan cara pemanasan kering,
seperti bagian yang terbuat dari karet.
f. Alat gelas lainnya seperti gelas Erlemeyer, gelas piala, pipet (ukur, volume) gelas ukur, labu
tentukur, cawan Petri. Sebelumnya harus dibungkus dengan kertas perkamen atau alufoil,
sedangkan labu Erlemeyer dan labu ukur atau labu tentukur harus ditutup dengan kapas
berlemak dan dilapisi alufoil. Untuk jenis pipet dapat disimpan dalam tabung logam tembaga
atau logam tahan karat yang bertutup.
g. Media untuk Pekerjaan Mikrobiologi. Setelah dilarutkan dalam air dan diatur pHnya,
dimasukkan dalam labu Erlemeyer yang sesuai, ditutup dengan kapas berlemak dan alufoil
baru dilakukan sterilisasi.

TUJUAN PERCOBAAN

Tujuan percobaan ialah ntuk mengetahui layak atau tidaknya alat ukur volume yang akan digunakan
di laboratorium.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

11
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1
12
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 ALAT DAN BAHAN
Pipet ukur/volume, Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, botol media, gelas ukur dan labu takar -
Autoklaf, Oven - Alumunium foil, kapas berlemak, tali kasur, kertas label dan gunting

PROSEDUR PERCOBAAN

1. Tiap kelompok, menimbang Nutrien Agar, Nutrien Broth, dan NaCl untuk pembuatan 50 mL.
Catatan : Nutrien Agar = 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth = 8 gram untuk 1000 mL, dan
NaCl fisiologis adalah 0,9% b/v.
2. Masukkan masing-masing media yang telah ditimbang ke dalam Erlenmeyer yang sudah diberi
tanda sesuai dengan nama media tersebut.
3. Tambahkan akuades 50 mL, lalu panaskan di atas nyala api bunsen sambil diaduk sampai
larutan tidak keruh lagi/jernih (awal larutan akan mendidih). 4. Tuangkan dalam botol media, lalu
tutup dengan kapas dan alumunium foil serta ikat dengan benang kasur. Setiap wadah media
harus diberi etiket.
Contoh :

4. Setelah steril, biarkan dahulu pada suhu kamar sampai suhunya sama dengan suhu kamar,
kemudian masukkan ke dalam lemari pendingin untuk disimpan. Media dan larutan pengencer
ini, akan dipergunakan pada praktikum selanjutnya. 7. Amati apakah media dan larutan
pengencer tersebut tetap steril (tetap jernih) atau telah terkontaminasi (menjadi keruh) selama
penyimpanan. Pengamatan dilakukan selama dua minggu.

HASIL PENGAMATAN

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

13
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM II
DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

PENDAHULUAN

Media dan Cara Pembuatan Media Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang
berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan
yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat
makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi,
memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba.
Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus sesuai
dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media harus
mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme, juga
mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik, derajat
keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril.
Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi
(contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti
vitamin.
Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik yaitu media yang
susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan untuk mempelajari
kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang susunan kimianya tidak
dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi
mikroba. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi : media cair, media padat, dan
media padat yang dapat dicairkan.

TUJUAN PERCOBAAN
Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media untuk
pertumbuhan mikroba.

ALAT DAN BAHAN

1. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)
2. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)
3. Aquades
4. Cawan petri
5. Tabung reaksi
6. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer, penangas/elemen pemanas

PROSEDUR PERCOBAAN
1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. (Catatan : Buatlah 50 ml media
NA untuk setiap kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB untuk satu golongan praktikum).
Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat, kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati
ke dalam erlenmeyer.
2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

14
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media tercampur homogen
(ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian :pada saat pemanasan jangan sampai terbentuk
buih berlebihan sampai meluap!
4. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet volume : 5 ml ke
dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA tegak, 15 ml untuk NA
dalam cawan petri untuk percobaan 4b (metode isolasi pour plate), sisanya untuk NA dalam cawan petri
untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba di alam). Tutup tabung reaksi denganpenutup tabung (penutupan
jangan terlalu rapat!)
5. Sebelum diautoklaf,tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok praktikum dalam 1 golongan.
Masingmasing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan
jangan terlalu rapat!)
6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit,
tekanan 1 atm 121oC. Pelajari cara mengoperasikan autoklaf dengan benar!
7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung dan biarkan
memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan
petri dan biarkan memadat (untuk percobaan 6 : pengenalan mikroba di alam). Media NA 15 ml dibiarkan
sampai suhu 45-50oC (untuk percobaan 4b : metode isolasi pour plate). Media NB dalam tabung reaksi
biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

15
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1
16
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM III
MIC GRAM POSITIF DAN NEGATIF

PENDAHULUAN
Suatu antibiotik mempunyai MIC yang berlainan terhadap bakteri tertentu. Kepekaan mikroba
terhadap antibiotik dapat dilihat dari konsentrasi minimum untuk inhibisi oleh suatu antibiotika
terhadap mikroba tertentu. Penetapan MIC dapat dilakukan dengan menguji sederetan konsentrasi
yang dibuat dengan pengenceran, metode yang digunakan dapat dengan cara turbidimetri ataupun
cara difusi agar. Konsentrasi terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat dinyatakan sebagai
konsentrasi minimum untuk inhibisi (MIC). Penentuan kepekaan mikroba terhadap antibiotika harus
dilakukan secara in vitro yang dinyatakan dalam MIC dan aktivitas penghambatannya pada MIC
tersebut. MIC ini tidak dapat dianggap akan setara dengan MIC in vivo karena dalam tubuh manusia
terjadi biotrasformasi antibiotika, terjadi penguraian atau fiksasi antibiotika pada protein plasma
sehingga aktivitas antibiotika akan berkurang. Setiap antibiotika mempunyai sifat farmakokinetik yang
berbeda tergantung pada sifat fisikokimianya dan karakteristik fisiologi individual pemakai.

TUJUAN PERCOBAAN
Menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) suatu sediaan uji terhadap bakteri Gram positif
maupun Gram negatif, dengan menggunakan metoda MIC cair atau MIC padat.

BAHAN DAN ALAT

ALAT
1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar dan kecil
3. Rak tabung
4. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml
5. Labu ukur 100 ml
6. Ose dan kompor spirtus
7. Inkubator
BAHAN
1. Sediaan uji
2. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif
3. Nutrient Broth (NB) double strength
4. Nutrient Broth (NB)
5. Pelarut sediaan uji
6. Air suling

PROSEDUR PERCOBAAN
1. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan pelarut awalnya. Kemudian
tambahkan pengencer akhir sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu
dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi campuran pada masingmasing tabung besar
dan tabung-tabung kecil.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam tabung-tabung reaksi
besar.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

17
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 4. Isi tabung reaksi kecil pertama dengan 1ml NB double strength, sedangkan tabung-tabung reaksi
selanjutnya dengan 1 ml NB biasa.
5. Pipet 1 ml hasil pengenceran terakhir ke dalam tabung 1 berisi NB double strength, kocok sampai
homogen.
6. Pipet 1 ml campuran dari tabung 1 ke tabung 2, kocok sampai homogen.
7. Ulangi langkah tersebut sampai tabung terakhir. Buang 1 ml campuran dari tabung terakhir.
8. Tambahkan 1 ose bakteri ke dalam masing-masing tabung kecil, kocok sampai homogen.
9. Ulangi langkah 3 sampai 7 untuk bakteri yang lain.
10. Buat 1 kontrol postif dan 1 kontrol negatif. Kontrol positif terdiri dari 1 ml NB dan 1 ose bakteri
(salah satu saja). Kontrol negatif hanya berisi 1 ml NB.
11. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Amati kekeruhan yang
terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
12. Tentukan dimana MICnya. MIC terletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak
menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri (berwarna bening, sesuai dengan kontrol negatif) )
dan konsentrasi pertama yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri (berwarna keruh).

PERHITUNGAN KONSENTRASI

HASIL PENGAMATAN
PENGAMATAN TABUNG REAKSI
KEKERUHAN 1 2 3 4 5 6 7 n

Keterangan :
(-) : bening
(+) : keruh

B. METODA MIC PADAT

ALAT DAN BAHAN
ALAT
1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi besar
3. Rak tabung
4. Cawan petri
5. Volume pipet berukuran 1 ml dan 10 ml
6. Labu ukur 100 ml
7. Ose dan kompor spirtus
8. Inkubator
BAHAN
1. Sediaan uji
2. Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

18
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 3. Nutrient Agar (NA)
4. Pelarut sediaan uji
5. Air suling

PROSEDUR
1. Masukkan sediaan uji ke dalam labu ukur, larutkan dengan pelarut awalnya. Kemudian
tambahkan pengencer akhir sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus dahulu
dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi campuran pada masing masing tabung besar
dan cawan-cawan petri.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam tabung-tabung reaksi
besar.
4. Bagi permukaan dasar cawan menjadi area-area sama besar. Beri label nama bakteri yang akan
digunakan pada setiap area.
5. Pipet 1 ml masing-masing pengenceran ke dalam cawan-cawan petri. Tambahkan 18 ml NA cair
bersuhu 40-50C, goyangkan beberapa saat, lalu diamkan sampai membeku
6. Goreskan masing-masing bakteri pada area yang terpisah dengan menggunakan ose. Buat
kontrol postif yang terdiri dari 20 ml NA dalam cawan petri, yang digores oleh bakter-bakteri yang
digunakan di area yang terpisah.
7. Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Amati pertumbuhan bakteri
dari koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi koloni-koloni tersebut dengan kontrol
positif.
8. Tentukan dimana MICnya. MIC terletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak
menunjukkan adanya pertumbuhan koloni bakteri dan konsentrasii pertama yang menunjukkan
adanya pertumbuhan koloni bakteri.

PERHITUNGAN KONSENTRASI

HASIL PENGAMATAN

PENGAMATAN TABUNG REAKSI

KEKERUHAN 1 2 3 4 5 6 7 n

Keterangan:
(-) : tidak ada pertumbuhan
(+) : ada pertumbuhan

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

19
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM IV
UJI CEMARAN MIKROBA DAN UJI STERILITAS

PENDAHULUAN
Jumlah mikroorganisme di dalam suatu sediaan, baik sediaan obat, obat tradisional, makanan
ataupun kosmetika dapat ditentukan dengan menghitung jumlah sel atau koloni. Hal ini biasa
dilakukan terutama untuk mengetahui tingkat cemaran mikroorganisme dalam produk tertentu atau
untuk mengetahui apakah sediaan tersebut bebas dari cemaran atau tidak. Penetapan jumlah sel
mikroorganisme hidup (viable count) adalah jumlah minimum mikroorganisme, karena koloni yang
tumbuh pada lempeng agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak
dalam media dan suhu inkubasi tertentu. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel
mikoorganisme, karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung untuk berkelompok. Bila
ditumbuhkan pada media dan lingkungan yang sesuai, kelompok bakteri ini hanya akan
menghasilkan satu koloni. Berdasarkan hal tersebut, seringkali digunakan istilah Colony Forming
Units (cfu/ml) untuk penghitungan jumlah mikroorganisme hidup. Sebaiknya, penghitungan koloni
dilakukan pada lempeng agar yang mengandung 30 – 300 koloni. Lempeng agar dengan jumlah
koloni yang tinggi (>300 koloni) sulit untuk dihitung, sehingga kemungkinan kesalahan perhitungan
sangat besar. Pengenceran sampel membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah yang benar,
namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempeng agar dengan jumlah koloni yang
kecil (<30 koloni). Lempeng agar demikian tidak abash secara statistic untuk digunakan dalam
penghitungan.

TUJUAN PERCOBAAN
Mahasiswa dapat melakukan penetapan jumlah cemaran mikroba yang terdapat pada
sediaan farmasi ( baik obat, kosmetika, maupun bahan baku), makanan serta minuman.

BAHAN DAN ALAT

Media Nutrien Agar (NA) atau media Plat Count Agar (PCA) - Media Sabouraud Dekstrosa Agar
(SDA) atau media Potato Dekstrosa Agar (PDA) + kloramfenikol 100 mg/1 liter media - Larutan NaCl
0,9% b/v - Cawan petri steril, tabung reaksi steril, rak tabung reaksi, pipet agar 20 mL steril, pipet
ukur 10 mL steril, pipet ukur 1 mL steril - Sampel yang akan diperiksa.

PROSEDUR PERCOBAAN

1. Cairkan media dalam tangas air. Setelah cair, biarkan dalam water bath 45- 500C selama kurang
lebih 30 menit.
2. Buat pengenceran desimal dari sampel dengan menggunakan NaCl 0,9% b/v steril, sampai
didapat pengenceran 10%.
3. Tandai cawan petri dengan nama media dan tingkat pengencerannya

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

20
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 4. Pipet 1 mL dari masing-masing pengenceran dan masukkan ke dalam cawan petri yang sesuai.
5. Tuangkan agar cair yang suhunya kurang lebih 500C dan homogenkan dengan cara
menggoyangkan cawan dengan gerakan searah jarum jam 5x dan gerakan berlawanan sebanyak
5x. Usahakan supaya tidak tumpah. Lakukan duplo untuk setiap pengenceran dan lakukan pula
kontrol media untuk setiap media. Keterangan : Media NA untuk penetapan jumlah bakteri aerob
Media SDA untuk penetapan jumlah kapang dan khamir
6. Biarkan agar padat, setelah itu inkubasi pada suhu yang sesuai. Media NA pada suhu 370C,
amati 1 – 5 hari Media SDA pada suhu 200C, amati 1 – 7 hari
7. Hitung jumlah koloni bakteri, kapang dan khamir yang tumbuh pada lempeng agar dan nyatakan
dalam satuan cfu/mL.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

21
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 Hasil Pengamatan

Media NA Jumlah koloni pada hari ke

1 2 3 4 5 6 7
Kontrol
media
Pengenceran
10-1

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

22
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
Pengenceran
10-2
Pengenceran
10-3
Pengenceran
10-4

Media SDA Jumlah koloni pada hari ke

1 2 3 4 5 6 7
Kontrol
media
Pengenceran
10-1
Pengenceran
10-2
Pengenceran
10-3
Pengenceran
10-4

UJI STERILITAS

TUJUAN PERCOBAAN
Mahasiswa dapat menentukan apakah sediaan/alat yang harus ada dalam kondisi steril,
memenuhi syarat sterilitas sebagai bagian persyaratan resmi dari pengawasan mutu.

PENDAHULUAN
Pengujian sterilitas dilakukan untuk menentukan apakah suatu sediaan, bahan/alat yang
harus dalam keadaan steril telah memenuhi syarat sterilitas, sebagai bagian dari
pengawasan mutu. Sterilitas dapat diartikan bahwa suatu sampel hanya dapat diyakini steril
jika sampel tersebut seutuhnya bebas dari mikroba viable. Kriteria sterilitas merupakan
persyaratan resmi untuk sediaan/bahan yang harus dalam kondisi steril, seperti sediaan
parenteral (injeksi), obat tetes mata, jarum suntik, alat kontrasepsi, benang bedah, dan lain-
lain. Pengujian sterilitas dilakukan terhadap hanya suatu bagian kecil dari suatu batch atau
lot sediaan, tetapi hasilnya harus dapat merefleksikan keadaan dari keseluruhan bacth/lot
tersebut. Jumlah sampel yang diambil untuk pemeriksaan sterilitas harus mewakili seluruh
batch dan jumlahnya harus cukup agar hasilnya dapat memenuhi batas-batas kenyakinan
yang memadai. Zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorgansme yang ada
dalam sediaan yang diperisa harus diinaktifkan atau dipisahkan dahulu sebelum inkubasi.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

23
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 Salah satu cara adalah dengan penggunaan membran filtrasi dan kemudian dilakukan
inkubasi dari membran tersebut di atas media biakan. Uji sterilitas dapat dilakukan dengan
dua cara, yaitu dengan cara inokulasi langsung sediaan ke dalam media uji dan dengan
teknik penyaringan membrane. Cara peyaringan terutama berguna untuk sediaan yang
mengandung cairan atau serbuk yang dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau
fungistatik

ALAT DAN BAHAN

Media Fluid Thioglycolat (FTM) - Media Tryptic Soybean Broth (TSB) - Suspensi Bacillus
subtilis dan Candida albicans - Tabung reaksi steril, rak tabung reaksi, pipet ukur 10 mL dan
1 mL steril, Bunsen, dan pinset.

PROSEDUR PERCOBAAN
Uji sterilitas meliputi beberapa tahap pengujian sebagai berikut :
1. Uji Sterilitas Media
Uji sterilitas media digunakan untuk melihat apakah media yang akan digunakan itu
steril atau tidak. Hasil yang didapat harus steril (media tetap jernih/tidak ada
pertumbuhan mikroba). Cara : Masukkan 10 mL media FTM dan TSB ke dalam tabung
reaksi. Inkubasi pada suhu 370C untuk FTM dan 200C untuk TSB, amati selama 1 - 14
hari. Lakukan duplo.
2. Uji Fertilitas
Uji fertilitas ini untuk melihat apakah media yang akan digunakan memenuhi syarat
dapat menumbuhkan mikroba uji atau tidak. Cara : Inokulasikan 1 mL suspensi mikroba
uji ke dalam 9 mL media dalam tabung reaksi. Bakteri Bacillus subtilis diinokulasikan
pada media FTM dan diinkubasikan pada suhu 35-370C, amati selama 1 - 14 hari.
Candida albicans diinokulasikan pada media TSB dan diinkubasikan pada suhu 20-
250C, amati selama 1 - 14 hari. Pengerjaan ini dilakukan duplo.
3. Uji Bakteriostatik dan Fungistatik
Sebelum melakukan uji sterilitas cara inokulasi langsung terhadap suatu sediaan,
tetapkan dahulu tingkat aktivitas bakteriostatik dan fungistatik yang mungkin terdapat
dalam sediaan yang akan diperiksa. Cara : Inokulasikan 1 mL suspensi mikroba dan 1
mL sediaan ke dalam 9 mL media pada tabung reaksi. Media FTM diinokulasikan
dengan Bacillus subtilis dan sediaan, inkubasikan pada suhu 35-370C, amati 1 – 14 hari.
Media TSB diinokulasikan dengan Candida albicans dan sediaan, inkubasikan pada
suhu 20-250C, amati 1 – 14 hari. Pengerjaan ini dilakukan duplo. Jika sediaan uji
menunjukkan adanya aktivitas bakteriostatik/fungistatik (sediaan uji menghambat
pertumbuhan mikroba uji, yang ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan mikroba
uji/media tetap jernih), maka dilakukan pengujian sterilitas dengan cara penyaringan.
Dengan penyaringan, zat bakteriostatik/fungistatik yang terdapat dalam sediaan uji akan
melewati membran. Sedangkan bila dalam sediaan uji terdapat mikroba, maka mikroba
akan tertahan pada membran. Membran ini yang akan diinokulasikan ke dalam media.
4. Uji Sterilitas Cara Inokulasi Langsung
Cara : inokulasikan 1 mL sediaan uji ke dalam 9 mL media pada tabung reaksi. Media
FTM dan TSB, masing-masing diinokulasikan dengan 1 mL sediaan uji. Inkubasikan di

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

24
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 suhu 370C untuk FTM dan 200C untuk TSB, amati selama 1 – 14 hari. Pengerjaan ini
dilakukan duplo.

HASIL PENGAMATAN

Nama Hari
Pengujian 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Uji Sterilitas
Media (FTM)
Uji Fertilitas
Uji
Bakteriostatik
Uji Sterilitas
Uji Sterilitas
Media (TSB)
Uji Fertilitas
Uji
Bakteriostatik
Uji Sterilitas

Keterangan:
(+) = terdapat pertumbuhan/keruh
(-) = tidak terdapat pertumbuhan/tetap jernih

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

25
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM V
PENENTUAN AKTIVITAS SENYAWA ANTIMIKROBA

PENDAHULUAN
Resistensi bakteri terhadap antibiotika membawa masalah tersendiri yang dapat menggagalkan terapi
dengan antibiotika. Resistensi dapat merupakan masalah individual dan epidemiologik. Resistensi
adalah ketahanan mikroba terhadap antibiotika tertentu yang dapat berupa resistensi alamiah,
resistensi karena adanya mutasi spontan (resistensi kromosomal) dan resistensi karena adanya faktor
R pada sitoplasma (resistensi ekstrakromosomal) atau resistensi karena pemindahan gen yang
resisten atau faktor R atau plasmid (resistensi silang). Beberapa mikroba tidak peka terhadap
antibiotika tertentu karena sifat mikroba secara alamiah tidak dapat diganggu oleh antibiotika tersebut.
Hal ini disebabkan oleh tidak adanya reseptor yang cocok atau dinding sel mikroba tidak dapat
ditembus oleh antibiotika. Resistensi kromosomal terjadi karena mutasi spontan pada gen kromosom.
Resistensi kromosomal dapat dibagi dalam dua golongan yaitu:
1. Resistensi kromosomal primer, dimana mutasi dapat terjadi sebelum pengobatan dengan
antibiotika dan selama pengobatan terjadi seleksi bibit yang resisten
2. Resistensi kromosomal sekunder, dimana mutasi terjadi selama kontak dengan antibiotika
kemudian terjadi seleksi bibit yang resisten.

TUJUAN PERCOBAAN
- Menentukan kerentanan suatu bakteri terhadap berbagai sediaan antibiotika, melalui tes
resistensi dengan metoda cakram kertas (paper disk).
- Mahasiswa mampu mengevaluasi daya antimikroba suatu desinfektan dengan
memperkirakan potensi dan efektifitas desinfektan berdasarkan konsentrasi dan lamanya
kontak terhadap mikroba dan membandingkannya terhadap fenol standard yang disebut
koefisien fenol
- Mahasiswa dapat melakukan penetapan respon mikroba terhadap zat antimikroba, yang
salah satu contoh pengujiannya adalah penetapan potensi antibiotika.

BAHAN DAN ALAT

1. Cawan petri, tabung reaksi, Oose, Labu takar 25mL dan 10mL
2. Inkubator, jangka sorong, vortex, stopwatch, pencadang logam, spektrofotometer, pH meter
3. Spirtus, lidi kapas, akuades steril, Fenol standar, kertas cakram, Mc Farland III Suspensi bakteri
uji : Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa
4. Nutrient Ager (NA), Nutrient Broth (NB), NaCl fisiologis 0,9%, larutan dapar pH 8,0 (larutan
pengencer), kloramfenikol standar.
5. Antibiotik uji, Desinfektan uji, Sampel uji

PROSEDUR PERCOBAAN

DIFUSI PAPER DISK

1. Tuangkan 20 ml NA cair bersuhu 40-50oC ke dalam masing-masing cawan petri, lalu diamkan
sampai membeku.
2. Dengan menggunakan lidi kapas steril, ulaskan suspensi bakteri uji ke seluruh permukaan agar
dalam cawan-cawan petri sampai merata. Biarkan selama kurang lebih 1 jam.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

26
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 3. Letakkan cakram-cakram antibiotika pada permukaan agar dengan jarak sedemikian rupa,
sehingga diharapkan tidak terjadi penumpukkan zona inhibisi.
4. Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 37 oC selama 18-24 jam. Ukur zona inhibisi yang terjadi
dengan menggunakan jangka sorong

KOEFISIEN FENOL
Pembuatan Media Nutrient Broth dimasukkan dalam 12 tabung reaksi ukuran 20 x 150 mm, volume
masing-masing dibuat 5 ml. Komposisi perliter terdiri dari pepton 10 g, ekstrak daging 5 g, dan NaCl
5 g; pH akhir 6,8. Pembuatan Inokulum Bakteri Pseudomonas aeruginosa atau Staphylococcus aureus
sebelumnya telah ditanam pada agar nutrisi (Nutrient Agar) miring dan diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24-48 jam. Tahap pengenceran bakteri uji adalah sebagai berikut:

1. Siapkan tabung reaksi berisi 2 ml NaCl fisiologis 0,9%

2. Pindahkan biakan P. aeruginosa atau S. aureus tersebut (pilih salah satu) ke dalam larutan
NaCl dengan ose, dan setarakan kekeruhannya dengan larutan Mc Farland III (109
mikroba/mL)
3. Suspensi bakteri tersebut kini diperkirakan berisi 109 mikroba/mL
4. Siapkan 3 buah tabung reaksi masing-masing berisi 4,5 ml NaCl fisiologis 0,9%
5. Pipet 0,5 mL dari suspensi mikroba sebelumnya (109 mikroba/mL), pindahkan ke salah satu
tabung reaksi berisi 4,5 ml NaCl. Suspensi mikroba kini berkonsentrasi 108 mikroba/mL
6. Lakukan pengenceran kedua dengan mengambil 0,5 ml dari suspensi mikroba 108 dan
memindahkannya ke dalam tabung berisi 4,5 NaCl yang kedua. Suspensi mikroba kini
berkonsentrasi107 mikroba/Ml
7. Pengenceran terakhir dilakukan dengan memindahkan 0,5 mL dari suspensi mikroba 107
ke dalam tabung terakhir NaCl. Suspensi mikroba telah setara dengan 106 mikroba/ml.
Suspensi bakteri dengan konsentrasi inilah yang akan digunakan untuk melakukan uji
praktikum ini. Pembuatan Baku Fenol Dibuat larutan persediaan baku fenol 5% dengan cara
menimbang 2,5 g fenol dalam 50 ml air suling steril. Kemudian dilakukan pengenceran
konsentrasi menjadi 1:80 dengan mempipet 12,5 ml larutan fenol 5% ditambahkan dengan
37,5 ml air suling steril pada tabung steril ukuran 25 x 150 mm.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

27
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 Pembuatan Larutan Desinfektan

Pengenceran larutan desinfektan dilakukan pada tabung steril berukuran 25 x 150 mm. Tahapannya
adalah sebagai berikut:
1. Siapkan 4 buah tabung steril berisi aquades dengan volume yang berbeda-beda di dalamnya
yaitu 9 ml, 7 ml, 4,5 ml, dan 7 ml, secara berurutan
2. Lakukan pengenceran pertama dengan mempipet 1 ml larutan desinfektan ke dalam 9 ml air
suling sehingga konsentrasi menjadi 1:10
3. Pengenceran selanjutnya adalah dengan memindahkan 1 ml desinfektan 1:10 ke dalam tabung
berisi 7 ml air suling. Konsentrasi desinfektan pada tabung ini adalah 1:80
4. Pindahkan 0,5 ml desinfektan 1:80 ke dalam 4,5 ml aquades sehingga konsentrasi kini 1:100
5. Pipet 0,5 ml desinfektan 1:100 ke dalam tabung berisi 7 ml air suling sehingga konsentrasi pada
tabung ini adalah 1:150
6. Desinfektan yang akan dipakai selanjutnya adalah yang konsentrasinya 1:80, 1:100, dan 1:150.
Oleh karena itu, samakan volumenya masing-masing menjadi 5 ml. Media, bakteri uji, larutan
fenol, dan desinfektan telah disiapkan. Dengan demikian kita dapat melakukan inokulasi
mikroba uji dalam desinfektan dan fenol dengan memperhitungkan waktu kontak 5, 10, dan 15
menit secara akurat. Label 12 tabung berisi Nutrient both dengan menandai F5’, F10’, F15’,
DES 1:80 5’, DES 1:80 10’, DES 1:80 15’, DES 1:100 5’, DES 1:100 10’, DES 1:100 15’, DES
1:150 5’, DES 1:150 10’, DES 1:150 15’.

Uji Fenol
Pipet inokulum berkonsentrasi 106 mikroba/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam larutan fenol 1:80. Tunggu
sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel F5’. Lima menit
kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung F10’. Setelah lima menit
kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung F15’.
1. Uji I 1:80 Pipet inokulum berkonsentrasi 106 mikroba/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan
1:80. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel DES
1:80 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

28
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80
15’.
2. Uji II 1:100 Pipet inokulum berkonsentrasi 106 mikroba/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan
1:100. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel
DES 1:100 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung
DES 1:100 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam
tabung DES 1:100 15’.
3. Uji III 1:150 Pipet inokulum berkonsentrasi 106 mikroba/ml sebanyak 0,5 ml ke dalam desinfektan
1:150. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung berlabel
DES 1:150 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung
DES 1:150 10’. Setelah lima menit kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam
tabung DES 1:150 15’. Tabung-tabung reaksi uji kemudian dieramkan di dalam inkubator pada
suhu 37°C selama 24-48 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada setiap tabung.
Pengamatan cara inokulasi mikroba ke dalam disinfektan :
(+)keruh : ada pertumbuhan
(-) jernih : tidak ada pertumbuhan

UJI POTENSI ANTIBIOTIK

1. Beri tanda cawan petri yang akan dipergunakan sesuai pola dengan menggunakan spidol.
2. Pembuatan Agar inokula 2% Agar inokula adalah campuran dari nutrien agar dengan suspensi
mikroba, yaitu untuk 100 mL agar ditambahkan 2 mL suspensi mikroba. Pencampuran ini
dilakukan dalam Erlenmeyer, yang kemudian setelah tercampur homogen dituangkan ke dalam
cawan petri yang telah bertanda sebanyak 20 mL. Biarkan padat.
3. Persiapan kloramfenikol standar Ditimbang sejumlah tertentu kloramfenikol standar dan
dilarutkan dalam aquadest steril hingga diperoleh larutan induk standar dengan konsentrasi 1000
μg/mL. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan larutan dapar pH 8,0 hingga diperoleh dosis
S1 – S5 .
4. Persiapan Larutan Uji Larutan uji dibuat dengan konsentrasi dosis sama dengan S3 atau R.
5. Setelah agar inokula padat, letakkan pencadang logam di atas agar tersebut. Kemudian teteskan
larutan standar dan larutan uji sebanyak 0,1 mL pada tiap tiap pencadang yang bertanda sama
dengan larutan yang akan diteteskan.
6. Pre inkubasi pada suhu kamar, selama 20 – 30 menit. Kemudian inkubasikan pada suhu 370C,
selama 18 – 24 jam. Amati diameter hambatan yang terjadi dan ukur. Hitung dengan
menggunakan perhitungan regresi.

HASIL PENGAMATAN
DIFUSI PAPER DISK
CAWAN ZONA INHIBISI (mm)
PETRI A B C D E
1
2

Keterangan:
A, B, C, D, E : Cakram-cakram antibiotika dengan konsentrasi tertentu

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

29
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 KOEFISIEN FENOL
Setelah tabung reaksi diinkubasi padsa suhu 37°C selama 24 - 48 jam, maka didapatkan hasil sebagai
berikut:

JENIS WAKTU/MENIT
PENGENCERAN 5 10 15
FENOL 1 : 80
DESINFEKTAN 1 : 80
DESINFEKTAN 1 : 100
DESINFEKTAN 1 : 150

UJI POTENSI ANTIBIOTIK

Diameter hambatan (mm x 10)
Seri I S1 R S1 R S1 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri II S2 R S2 R S2 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri III S3 R S3 R S3 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri IV S4 R S4 R S4 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri V U R U R U R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

30
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM VI
UJI KEPEKAAN ANTIBIOTIK:
PENENTUAN KHM

PENDAHULUAN
Suatu antibiotika mempunyai KHM yang berlainan terhadap bakteri tertentu. Kepekaan
mikroba terhadap antibiotik dapat di lihat dari konsentrasi minimum untuk inhibisi oleh suatu
antibiotika terhadap mikroba tertentu. Penetapan KHM dapat dilakukan dengan menguji sederetan
konsentrasi yang di buat dengan pengenceran, metode yang digunakan dapat dengan cara
turbidimetri ataupun cara difusi agar. Konsentrasi terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat
dinyatakan sebagai konsentrasi minimum untuk inhibisi (KHM). Penentuan kepekaan mikroba
terhadap antibiotika harus dilakukan secara invitro yang dinyatakan dalam KHM dan aktivitas
penghambatannya pada KHM tersebut. KHM ini tidak dapat di anggap akan setara dengan KHM in
vivo karena dalam tubuh manusia terjadi biotransformasi antibiotika, terjadi penguraian atau fiksasi
antibiotika pada protein plasma sehingga aktivitas antibiotika akan berkurang. Setiap antibiotika
mempunyai sifat farmakokinetika yang berbeda tergantung pada sifat fisikokimianya dan karakteristik
fisiologi individual pemakai.

TUJUAN PERCOBAAN
Mahasiswa dapat menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) suatu sediaan uji terhadap
bakteri gram positif maupun gram negatif, dengan menggunakan metoda dilusi atau difusi

ALAT DAN BAHAN

Alat :
mortir dan stampler, tabung reaksi besar dan kecil, rak tabung, pipet volume berukuran 1 mL dan 10
mL, cawan petri sterilLabu ukur 100 mL, Oose, spirtus daninkubator.
Bahan :
Sediaan uji, Berbagai suspensi bakteri gram positif dan gram negatif, Nutrien Broth (NB) double
strenght, Nutrien Broth (NB), pelarut sediaan uji, air suling, Nutrien Agar (NA).

PROSEDUR PERCOBAAN

METODE DILUSI
1. Masukkan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya. Kemudian
tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus
dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan perhitungan konsentrasi campuran pada masing-

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

31
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 masing tabung besar dan tabung-tabung kecil.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan uji dengan air suling dalam tabung-tabung reaksi
besar.
4. Isi tabung reaksi kecil pertama dengan 1 mL NB Double Strenght, sedangkan tabung-
tabung reaksi selanjutnya dengan 1 mL NB biasa.
5. Pipet 1 mL hasil pengenceran terakhir ke dalam tabung 1 berisi NB double strength,
kocok sampai homogen.
6. Pipet 1 mL campuran dari tabung 1 ke tabung 2, kocok sampai homogen.
7. Ulangi langkah tersebut sampai tabung terakhir. Buang 1 mL campuran dari tabung
terakhir.
8. Tambahkan 1 ose bakteri kedalam masing-masing tabung kecil, kocok sampai
homogen.
9. Ulangi langkah 3 sampai 7 untuk bakteri yang lain.
10. Buat kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif terdiri dari 1mL NB dan 1 ose
bakteri (salah satu saja). Kontrol negatif hanya berisi 1mL NB
11. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Amati kekeruhan
yang terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
12. Tentukan dimana KHM nya. KHM terletak pada tabung bening yang terakhir atau
sebelum tabung keruh pertama.

METODE DIFUSI
1. Masukkan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya. Kemudian
tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji berbentuk padat, gerus
dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam labu ukur.
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi campuran pada masing-masing
tabung besar dan cawan-cawan petri.
3. Buat pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dengan air suling dalam tabung-tabung
reaksi besar.
4. Bagi permukaaan dasar cawan menjadi area-area sama besar. Beri label nama bakteri
yang akan digunakan pada setiap area.
5. Pipet 1 mL masing-masing pengenceran kedalam cawan-cawan petri tambahkan 19 mL

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

32
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 NA cair bersuhu 40-50oC, goyangkan beberapa saat, lalu diamkan sampai membeku.
6. Goreskan masing-masing bakteri pada area yang terpisah dengan menggunakan ose.
Buat kontrol positif yang terjadi dari 20 mL NA dalam cawan petri, yang digoreskan oleh
bakteri-bakteri yang digunakan di area yang terpisah.
7. Inkubasikan semua cawan petri pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Amati pertumbuhan
bakteri dari koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi koloni-koloni tersebut
dengan kontrol positif.
8. Tentukan dimana KHM-nya. KHM terletak pada cawan petri terakhir yang tidak tampak
koloni bakteri.

HASIL PENGAMATAN
A. METODE DILUSI
PENGAMATAN TABUNG REAKSI
1 2 3 4 5 6 7 n
KEKERUHAN

B. METODE DIFUSI

JENIS CAWAN PETRI

BAKTERI
1 2 3

Keterangan :
(+) : tidak ada pertumbuhan
(-) : ada pertumbuhan

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

33
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 PRAKTIKUM VII
PENENTUAN DAYA HAMBAT SEBAGAI
ANTISEPTIK

PENDAHULUAN
Untuk menentukan kualitas desinfektan yaitu menentukan daya bunuh desinfektan terhadap
kuman adalah dengan menggunakan metode koefisien fenol. Fenol adalah jenis desinfektan yang
paling kuno dan karena kekuatannya telah diketahui maka kualitas desinfektan selalu dibandingkan
dengan fenol. Koefisien fenol adalah bilangan pecahan yang menunjukkan perbandingan kekuatan
daya bunuh dari desinfektan dibandingkan dengan kekuatan daya bunuh dari fenol sebagai
pembanding dalam kondisi yang sama, yaitu jenis bakteri yang sama dan waktu kontak yang sama.
Waktu untuk menguji antibiotika adalah 18-24 jam, sedangkan untuk mata tidak mungkin selama itu.
Oleh karena itu, digunakan waktu tertentu dengan metode kontak secara konvensional, waktu yang
paling cepat adalah 2,5 menit, paling lama 15 menit. Kekuatan fenol untuk menguji desinfektan
adalah tidak lebih besar dari 5%.

TUJUAN PERCOBAAN

Menentukan daya hambat suatu sediaan yang berpotensi sebagai antiseptika atau desinfektan,
dengan membandingkannya terhadap standar fenol (koefisien fenol).

ALAT DAN BAHAN

ALAT
Mortir dan stamfer ,Tabung reaksi besar dan kecil, Rak tabung, Volume pipet berukuran 1 ml dan 10
ml 5. Labu ukur 100 ml, Ose dan kompor spirtus, Stopwatch, Inkubator
BAHAN
Sediaan uji, Bakteri uji, Nutrient Broth (NB) double strength, Nutrient Broth (NB Fenol, Air suling,
Pelarut sediaan uji

PROSEDUR PERCOBAAN
1. Buat larutan sediaan uji dan larutan standar fenol dengan konsentrasi 5 % b/v atau 5 %
v/v
2. Rencanakan pengenceran dan hitung konsentrasi larutan pada masing-masing tabung
besar.
3. Buat 6 pengenceran bertingkat larutan sediaan uji dan larutan standar fenol dengan air
suling dalam tabung-tabung reaksi besar.
4. Isi 12 tabung reaksi kecil dengan 1 ml NB double strength, sedangkan tabung-tabung

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

34
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 reaksi selanjutnya (60 tabung) diisi dengan 1 ml NB biasa.
5. Susun tabung-tabung besar dan kecil dalam rak tabung. Baris pertama terdiri dari 6
tabung besar yang berisi hasil pengenceran, beri tanda A,B,C,D,E dan F. Baris kedua
berisi 6 tabung kecil berisi NB double strength, beri tanda a1, b1, c1, d1, e1 dan f1. Baris
ketiga sampai keenam masing-masing berisi 6 tabung kecil berisi NB biasa, beri tanda
a2, b2, c2, d2, e2, f2 sampai a6, b6, c6, d6, e6 dan f6. Buat susunan ini untuk sediaan
uji dan standar fenol.
6. Masukkan 0,2 ml suspensi bakteri uji pada masing-masing tabung besar secara berurut,
dengan rentang waktu 30 detik
7. Masukkan masing-masing 1 ose larutan dari tabung A secara berurut ke tabung a1, a2,
a3, a4, a5 dan a6 secara berurut, selama 2,5 menit Lakukan juga untuk tabung-tabung
B,C,D,E dan F.
8. Buat 1 kontrol postif dan 1 kontrol negatif. Kontrol positif terdiri dari 1 ml NB dan 1 ose
bakteri (salah satu saja). Kontrol negatif hanya berisi 1 ml NB.
9. Inkubasikan semua tabung kecil pada suhu 37C selama 18-24 jam. Amati kekeruhan
yang terjadi, bandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
10. Tentukan dimana koefisien fenolnya dengan rumus sebagai berikut:

Koefisien fenol = (A:B) + (C:D) / 2

Keterangan :
A = konsentrasi fenol tercepat membunuh
B= konsentrasi desinfektan tercepat membunuh
C= konsentrasi fenol terlama membunuh D= konsentrasi desinfektan terlama membunuh

PERHITUNGAN KONSENTRASI

HASIL PENGAMATAN
Waktu 2.5 menit 5 menit 7.5 menit 10 menit 12.5 menit 15 menit
Konsentrasi

Keterangan :
(-) : bening
(+) : keruh

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

35
FARMASI STIKES TUJUH BELAS
 Daftar Pustaka
ASEAN Countries, 1993, Standard of ASEAN Herbal Medicine, Vol.1, ASEAN Countries,
Jakarta

Atlas, R.M., Handbook of Microbiological Media, CRC Press, Boca Raton, 1993.

Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2006. Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik.
Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan.

Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2012. Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik.
Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan.

Bedwell, J., Kairo, S. K., Behr, M. A. dan Bygraves, J. A. (2001) : Identification of substrains of
BCG vaccine using multiplex PCR, Vaccine, 19, 2146 – 2151.

Board, RG., A Modern Introduction to Food Microbiology, Blackwell Sci.Publ., London, 1983
Buckle, K.A, et.al. (Eds.), Foodborne Microorganisms of Public Health Significance, 4th ed.,
AIFST (NSW Branch)

Food Microbiology Group, NSW, 1989. Deacon, J.W., Modern Mycology, 3rd edition, Blackwell
Science Ltd.,1997.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995) : Farmakope Indonesia edisi IV, Jakarta, 10
– 14, 855 – 863.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2009) : Suplemen I Farmakope Indonesia edisi IV,
Jakarta, 1512 – 1519.

Farmakope Indonesia edisi IV, Dep.Kes RI, 1995.

Frazier WC., et al, Food Microbiology, Tata McGraw Hill, Bombay, 1992. Gams, W., van der Aa,
H.A., van der Plaats-Niterink,A.J., Samson R.A., and Stalpers J.A., CBS Course of Mycology,
Centraalbureau

Voor Schimmelcultures, Delft, 1987. Harmonization Of Asean Cosmetic Methods, 2004,

Microbiological Methods for Cosmetics, Thailand Hitchin, A.D.

Tony, T.T. and James, E.M., 1992, Microbiological Methods for cosmetics in Bacteriological
Analyctical Manual, 7th ed, AOAC International, Arlington, USA.

International Organization for Standardization (ISO). 1999. Classification of Airborne

Particulates in Ruang Bersih and Associated Controlled Environments-Part 1. Geneva: ISO
14644-1.

MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI S1

36
FARMASI STIKES TUJUH BELAS