Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Konsentrasi Absorbansi
0 ppm 0
100 ppm 0.155
200 ppm 0.250
300 ppm 0.372
400 ppm 0.413
500 ppm 0.547
600 ppm 0.564
700 ppm 0.590
800 ppm 0.761
Sampel Absorbansi
Absorbansi
0.8
0.7 f(x) = 0 x + 0.06
0.6 R² = 0.97
0.5
Absorbansi
Absorbansi
0.4
Linear (Absorbansi)
0.3
0.2
0.1
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Konsentrasi
Perhitungan:
Untuk menghitung sampel biji kering, biji direndam 12 jam, kecambah umur 12
jam, kecambah umur 24, kecambah umur 48 jam dalam praktikum dapat dihitung
melalui persamaan kurva standar yakni y = 0,0009x + 0,00623. Sehingga
didapatkan perhitungan sebagai berikut,
Kering
y=0,0009+ 0,00623
0,150=0,0009+0,00623
x=97,44 ppm
Rendam 12 jam
y=0,0009+ 0,00623
0,016=0,0009+0,00623
x=−51,4 ppm
Kecambah 12 jam
y=0,0009+ 0,00623
0,035=0,0009+0,00623
x=−30,33 ppm
Kecambah 24 jam
y=0,0009+ 0,00623
0,095=0,0009+0,00623
x=36,33 ppm
Nama : M. Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Kecambah 48 jam
y=0,0009+ 0,00623
0,220=0,0009+0,00623
x=175,22 ppm
Konsentrasi AktivitasEnzim
Perlakuan Absorbansi
(ppm) (Unit/mikromol)
1 1unit
¿−51,4 × ×10 ×
10 1 mikromol
¿−51,4 unit per mikromol
1 1 unit
¿ 175,22× ×10 ×
10 1 mikromol
¿ 175,22unit per mikromol
c. Perbandingan Kurva Absorbansi Larutan Standar Maltosa dengan Kurva
Absorbansi Larutan Sampel
Berdasarakan praktikum yang telah dilakukan, didapatkan 2 macam kurva
yakni Kurva Absorbansi Larutan Standar Maltosa dengan hasil persamaan y =
0,0009x + 0,0623 dan Kurva Absorbansi Larutan Sampel dengan hasil
persamaan y = 0,001x + 0,0495 .Jika dilihat dari kedua hasil persamaan
tersebut, dapat analisa bahwa kedua kurva tersebut memiliki perbedaan yang
signifikan, karena pada kurva absorbansi larutan sampel kurva mengalami
penurunan di awal dan meningkat drastis di akhir. Nilai absorbansi yang tinggi
menunjukkan bahwa bemakin banyak komponen pereduksi yang ada pada
sampel, sehingga semakin banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid
yang terbentuk dan mengakibatkan serapan yang terdeteksi pada spektrofotmetri
semakin tinggi sehingga nilai absorbansi menjadi tinggi. Semakin tinggi nilai
absorbansi, maka semakin tinggi konsentrasi yang didapatkan dan semakin
tinggi pula nilai aktivitas enzim amilase yang didapatkan.
Namun, pada sampel pertama (biji kering) hingga sampel ketiga
(kecambah 12 jam) cenderung mengalami penurunan nilai absorbansi yang
tentunya akan menjadikan penurunan konsentrasi pada kurva. Kurva masih
tampak linier dengan persamaan y = 0,001x + 0,0495 dengan R2=0.1.
Semakin besar nilai R, maka nilai akurasinya akan semakin bagus.
Berdasarkan literatur, kurva standar diperoleh dengan mengukur absorban dari
sederetan konsentrasi larutan standar. Nilai R yang tidak berbeda jauh antara
dua data menyatakan bahwa konsentrasi pembuatan pengeceran larutan hampir
akurat (Kodri, 2013).
E. Analisa Prosedur
Pada pengujian enzim amilase langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan
alat dan bahan. Alat yang digunakan ada praktikum kali ini adalah satu buah pipet ukur
ukuran 5 ml, satu buah pipet ukur ukuran 10 ml, bulb, tabung reaksi, satu buah rak tabung
reaksi, erlenmeyer, mortar, beaker glass dua buah, dan pipet tetes. Bahan yang
digunakan adalah kacang hijau, dan direndam, DNS, aquades dan larutan maltosa.
Setelah menyiapkan alat dan bahan langkah selanjutnya adalah menyiapkan sampel yaitu
kacang hijau yang kemudian ditimbang sebanyak 50 gr menggunakan timbangan analitik
kemudian dibagi sampel menjadi 5 perlakuan yaitu 10 gr biji kacang hijau kering, 10 gr
kacang hijau yang direndam selama 12 jam, 10 gr biji kacang hijau yang dikecambahkan
12 jam, 10 gr kacang hijau yang dikecambahkan 24 jam dan 10 gr kacang hijau yang
dikecambahkan 48 jam. Kemudian sampel ditumbuk dan ditimbang sebanyak 5 gr
menggunakan mortar hingga halus. Fungsi penumbukan menggunakan mortar adalah
untuk mengeluarkan enzim α-amilase yang terdapat di dalam sel, dan memperkecil
ukuran sehingga luas permukaan semakin besar yang dapat mempercepat jalannya
reaksi. Setelah itu sampel yang sudah ditumbuk dan ditimbang sebanyak 5 gr
dimasukkan kedalam erlenmeyer kemudian ditambahkan 50 ml larutan buffer asetat (0,1
– 0,5 M) dengan pH 5.5 yang berfungsi untuk mempertahankan pH lingkungan sehingga
membuat kinerja enzim optimum karena range pH aktif enzim amilase adalah 4,5 – 8.
Nama : M. Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Kemudian didiamkan selama 30 menit sambil diaduk sesekali agar homogen. Fungsi
pendiaman larutan buffer asetat dan sampel adalah untuk membiarkan enzim bekerja
dengan baik. Setelah itu disaring menggunakan kertas saring Whatman dengan
erlenmeyer dibawahnya. Fungsi penyaringan adalah untuk mendapatkan filtrat yang
berupa enzim amilase. Setelah dilakukan penyaringan maka beaker glass yang berisi
sampel ditimbang pada timbangan analitik kemudian dikonversi dan dimasukkan valkon.
Setelah dilakukan penimbangan kemudian masing-masing sampel diambil 10 ml
dengan menggunakan pipet ukur ukuran 10 ml dan dimasukkan ke dalam valkon hingga
berat masing-masing sampel mencapi 12 gram setelah itu dilakukan sentrifugasi, pada
berat masing-masing sampel harus memiliki berat yang sama agar pada proses
sentrifugasi dapat seimbang sehingga diperoleh hasil yang sesuai. Setelah itu sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 30 menit. Fungsi sentrifugasiadalah
untuk memisahkan supernatan dan natan dan memisahkan padatan dengan ekstrak.
Setelah dilakukan sentrifugasi masing-masing sampel diambil 1 ml supernatannya dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditutup menggunakan aluminium foil pada
bagian mulut tabung reaksi.
Setelah itu masing-masing pada sampel dilakukan tahap pengujian aktivitas enzim
amilase. Masing-masing tabung reaksi yang berisi supernatan ditambahkan 1 ml larutan
substrat pati menggunakan pipet ukur ukuran 5 ml yang dibuat dengan cara melarutkan
0,2 gram soluble starch dengan ditambahkan 20 ml aquades, kemudian dipanaskan dan
diaduk hingga jernih dan homogen. Penambahan larutan substrat pati berfungsi sebagai
bahan atau substrat yang akan dihidrolisis oleh enzim. Setelah penambahan substrat pati
kemudian tabung reaksi ditutup dengan alumunium foil pada mulutnya. Setelah itu
diinkubasi selama 10 menit. Setelah diinkubasi, ditambahkan 2 ml larutan DNS yang
berfungsi sebagai untuk mengukur aktivitas enzim, yang akan berikatan dengan gula
pereduksi yang dihasilkan dari pemcahan sehingga menghasilkan warna merah jingga.
Setelah itu, mulut tabung reaksi ditutup menggunakan aluminium foil dan dipanaskan
menggunakan beaker glass yang sudah diisi air diatas kompor listrik hingga mendidih.
Fungsi pemanasan adalah untuk mempercepat reagen DNS bereaksi dan menginaktifasi
enzim, penginaktifasian enzim ini agar enzim tidak bekerja sehingga dapat diukur dengan
stabil nantinya. Kemudian tabung reaksi didinginkan menggunakan aquades mengalir
yang bertujuan untuk mendinginkan bahan sehingga tidak terjadi kerusakan pada alat
spektrofotometer ketika pengukuran absorbansi larutan.
Setelah pendinginan, langkah selanjutnya adalah pengukuran absorbansi larutan
dengan menggunakan alat spektrofotometer. Langkah pertama adalah pengkalibrasian
alat dengan larutan blanko yaitu aquades. Kuvet dibersihkan terlebih dahulu
menggunakan aquades pada bagian terang dan buram secara merata kemudian di lap
menggunakan tisu dengan satu arah setelah itu diisi larutan aquades lalu alat
spektrofotometer dengan menekan tombol hijau dan diatur panjang gelombangnya 540
nm setelah itu dikeluarkan larutan blanko kemudian dimasukkan kuvet yang berisi
masing-masing sampel kemudian diukur nilai absorbansinya pada pergantian antar
sampel yang selanjutnya spektofotometer harus di kalibrasi agar hasilnya tidak minus.
Dan lakukan hal tersebut hingga semua sampel telah diukur. Setelah mendapatkan
seluruh pengukuran absorbansi pada sampel maka didapatkan hasil pembuatan kurva
percobaan.
Fungsi dari reagen DNS adalah untuk mengukur aktivitas enzim yang akan
berikatan dengan gula pereduksi hasil hidrolisis substrat pati oleh enzim amilase dimana
reagen DNS akan terduksi oleh gula pereduksi dalam sampel menjadi asam 3-amino-5-
dinitrosalisilat yang mudah menyerap gelombang elektromagnetik. Semakin enzim
amilase dapat bekeja dengan baik maka semakin banyak pati yang dihidrolisis menjadi
maltosa atau gula disakarida lainnya. Menurut literatur, semakin banyaknya jumlah gula
pereduksi maka perubahan warna akan semakin jingga (Joanda et al, 2013). Apabila
warna larutan sampel semakin berwarna merah atau kuning jingga, hal itu menunjukkan
bahwa reagen DNS banyak yang bereaksi dengan maltosa. Selain itu, juga dapat
menunjukkan aktivitas enzim amilase yang terjadi dalam sampel semakin tinggi dan nilai
absorbansi pada spektrofotometer juga semakin besar. Nilai absorbansi pada
spektrofotometer berpengaruh pada data aktivitas enzim pada sampel.
Dari seluruh data di atas, dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim α-amilase
tertinggi terdapat pada sampel kacang hijau yang dikecambahkan selama 48 jam.
Semakin lama proses perkecambahan maka semakin tinggi pula aktivitas enzimnya
karena kacang hijau membutuhkan nutrisi yang lebih banyak untuk proses
perkecambahan sehingga aktivitas enzim amilase pada kecambah umur 48 jam yang
paling tinggi (Kodri, 2013). Namun terdapat penurunan konsentrasi pada kecambah 24
jam, karena adanya kesalahan pada proses ekstraksi atau kondisi yang diciptakan belum
terlalu sesuai dengan kondisi optimum kerja enzim amilase sehingga kerjanya menjadi
tidak maksimal dan menghasilkan beberapa data yang melenceng.
Kesimpulan
Prinsip dari ekstraksi dan uji aktivitas enzim amilase adalah menguji aktivitas enzim
amilase dari kecambah biji-bijian dimana aktivitas enzim amilase ditunjukan dan diukur dari
banyaknya maltosa yang terbentuk ditandai dengan perubahan warna dari kuning menjadi
merah-jingga setelah direaksikan dengan reagen DNS. Dimana pada uji ini dalam mengukur
aktivitas enzim amilase menggunakan substrat berupa pati yang kemudian akan dipecah
oleh enzim membentuk maltosa.
Tujuan dari praktium kali ini adalah untuk mengetahui kadar aktivitas enzim amilase
yang diekstrak dari beberapa sampel dengan perlakuan yang berbeda serta agar mampu
melakukan ekstraksi enzim amiasi dari baan pangan. Faktor yang mempengaruhi adalah
suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan inhibitor. Hasil kurva sampel yang
diperoleh melalaui perhitungan adalah linear atau sesuai dengan kurva standar yang ada.
Semakin tinggi nilai absorbansi maka semakin banyak konsentrasi serta semakin besar
aktivitas enzim amilase.
Dari data hasil praktikum didapatkan hasil bahwa yang memiliki aktivitas enzim
amilase paling tinggi adalah kacang hijau yang dikecambahkan selama 48 jam dengan nilai
175,22 unit per mikromol dengan nilai absorbansinya 0,22 dan konsentrasi 175,22 ppm.
Nama : M. Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Bahri, Syaiful, Moh. Mirzan, dan Moh. Hasan. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase Dari
Kecambah Biji Jagung Ketan (Zea mays ceratina L.). Jurnal Natural Science Vol. 1.(1)
132-143. Palu: Universitas Tadulako
Basit, Wajih Abdul, et al. 2013. Kinetika Reaksi Enzimatis. Bogor: Institut Pertanian Bogor
Joanda, Alif, et al. 2013. Enzim Amilase pada Kacang Hijau. Jakarta: ISTN
Kodri,et al. 2013. Utilization Enzymes Cellulase from Trichodermareesei and Aspergillusniger
For Enzymatic Hydrolysis of Rice Straw Catalyst with Microwave Pretreatment. Jurnal
Bioproses Komoditas Tropis Vol. 1 No. 1.
Rahmawati, I. 2013. Ekstraksi dan Pengujian Aktivitas Enzim Amilase. Bogor: Institut
Pertanian Bogor
Reed, Gerald. 2012. Enzymes in Food Processing. New York: Academic Press
Susanti, Devi. 2010. Amobilisasi Enzim Α-Amilase Dari Bacillus subtilis ITBCCB 148 Dengan
Menggunakan Karboksil Metil Selulosa (CMC). Lampung: Universitas Lampung
Nama : M. Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Susanti, Devi. 2010. Amobilisasi Enzim Α-Amilase Dari Bacillus subtilis ITBCCB 148 Dengan
Menggunakan Karboksil Metil Selulosa (CMC). Lampung: Universitas Lampung
Bahri, Syaiful, Moh. Mirzan, dan Moh. Hasan. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase Dari
Kecambah Biji Jagung Ketan (Zea mays ceratina L.). Jurnal Natural Science Vol. 1.(1)
132-143. Palu: Universitas Tadulako
Nama : M. Iqbal Baihaqi
NIM : 165100101111007
Kelas :G
Kelompok : G4
Reed, Gerald. 2012. Enzymes in Food Processing. New York: Academic Press