SEMEN BEKU

LEARNING OBJECTIVE
1. PROSES PEMBUATAN SEMEN BEKU
2. KANDUNGAN KOMPOSISI SEMEN
Proses Pembuatan Semen Beku
Preservasi Semen pada Domba
Penampungan Semen
Penampungan semen dilakukan dengan vagina buatan yang terdiri atas tabung karet yang
berlubang pentil, karet inner liner, karet pengikat, corong karet, dan tabung penampung berskala.
Air panas (40-52oC) dimasukkan ke dalam vagina buatan melalui lubang pentil hingga mencapai
setengah bagian, kemudian lubang pentil ditutup dan dipompa. Kekenyalan vagina buatan diukur
dengan jari jika dirasakan cukup, karet bagian luar vagina buatan diberi vaselin hingga 1/3
bagian panjangnya. Domba betina pemancing (teaser) dimasukkan ke dalam service create,
selanjutnya domba pejantan dibiarkan mendekati domba betina pemancing beberapa kali untuk
meningkatkan libido dan setelah domba pejantan menaiki pemancing, bagian preputium
dipegang, ujung penis diarahkan ke lubang vagina buatan dengan posisi miring. Semen yang
tertampung segera dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis.
Pengenceran Semen
Setelah diketahui jumlah volume pengencer sampelsemen dibagi dua bagian, satu bagian
diencerkan dengan Sitrat-kuning telur dan satu bagian lagi diencerkan Tris-kuning telur melalui
metode pengenceran satu tahap (one step method). Pengenceran dengan metode satu tahap,
dilakukan dengan cara memasukkan pengencer melalui dinding gelas erlenmeyer yang berisi
semen secara perlahan hingga seluruh pengencer tercampur homogen. Pencampuran antara
semen segar dan pengencer dilakukan pada suhu kamar atau menggunakan water bath bersuhu
30oC.
Ekuilibrasi
Proses ekuilibrasi dilakukan setelah sampel semen dicampur dengan masing-masing bahan
pengencer pada gelas erlenmeyer yang telah diberi label SKT (sitratkuning telur) dan TKT (triskuning telur), berlangsung selama 2 jam di dalam lemari pendingin (refrigerator) bersuhu 5oC.
Selama proses ekuilibrasi berlangsung, sampel semen pada setiap perlakuan pengencer sitrat dan
tris-kuning telur dilakukan penambahan gliserol sebanyak 7% dari total volume pengencer secara
perlahan-lahan melalui dinding gelas Erlenmeyer (proses gliserolisasi) sampai seluruhnya
tercampur merata.
Pengisian straw (packing)
Pengisian straw dilakukan dengan menggunakan filler (mikropipet) yang dihubungkan dengan
slang plastik pada alat penghisap. Bagian ujung ministraw yang terbuka ditutup dengan cryoseal

atau alat sealer. Ministraw dibedakan dalam tiga warna yaitu biru untuk tingkat perlakuan laju
penurunan suhu 7oC/menit; kuning untuk tingkat perlakuan laju penurunan suhu 13oC/menit,
dan merah untuk tingkat perlakuan laju penurunan suhu 20oC/menit. Sedangkan untuk
membedakan jenis pengencer straw ditandai kertas label SKT dan TKT, setiap perlakuan diulang
4 kali.
Pembekuan Semen
Pembekuan semen dilakukan secara manual menggunakan kotak styrofoam, yang dibagi menjadi
tiga ruang pembekuan yang sama. Di dalam setiap ruang pembekuan terdapat wadah aluminium
penampung N2 cair, dan rak tempat straw dengan ketinggian berbeda, berturut-turut 10, 11 dan
12 cm dari permukaan N2 cair. Bagian atas kotak Styrofoam diisolasi dengan kaca setebal 5 mm,
dan pada setiap ruangan diberi lubang untuk memasukkan sensor thermometer digital saat
mengamati suhu pembekuan. Proses pembekuan pada setiap ruangan, diawali dengan
menuangkan N2 cair ke dalam wadah aluminium pada setiap ruang pembekuan setinggi 5 cm.
Selanjutnya straw diletakkan pada rak-rak yang ada, dengan bagian atas ditutup kaca sebagai
isolator. Untuk memperoleh suhu pembekuan yang berbeda, straw dibekukan hingga 80oC pada
tiga tingkat suhu uap N2 yaitu -95, -105, dan -135oC, yaitu dengan cara mengatur ketinggian rak
tempat straw dari permukaan N2 cair, setinggi 12, 11, dan 10 cm. Straw warna biru dibekukan
pada ketinggian rak 12 cm di atas permukaan N2 cair, selama 2 menit 50 detik, straw kuning
pada ketinggian rak 11 cm selama 1 menit 55 detik, dan straw merah pada ketinggian 10 cm
selama 1 menit 45 detik, hingga mencapai suhu pembekuan 80oC.
Evaluasi Semen Beku
Evaluasi semen beku dilakukan setelah straw di thawing di dalam minitub bersuhu 39oC selama
2 menit, sampai semen dalam straw benar-benar mencair, kemudian sampel semen dikeluarkan
untuk dievaluasi secara mikroskopis sesuai dengan peubah yang diamati (Herdiawan., 2004).
Preservasi Semen pada Anjing
Spermatozoa dapat bertahan hidup pada ejakulat tanpa pengencer dalam waktu yang singkat
sampai maksimal 21 jam. Apabila semen akan digunakan dalam waktu yang agak lama misalnya
dikirim ke luar kota maka semen perlu diencerkan dan didinginkan.
Pengencer ditambahkan ke semen untuk mengubah buffer PH; untuk memberikan sumber energi
bagi spermatozoa; untuk mencegah pertumbuhan bakteri; dan untuk mencegah kerusakan
spermaozoa selama pendinginan, pembekuan, thawing. Beberapa pengencer dapat digunakan
untuk pendinginan semen maupun untuk pembekuan semen; dan krioproektan seperti gliserol
diperlukan hanya pada pengencer yang digunakan untuk semen beku. Penegencer semen anjing
secara komersial telah tersedia, tetapi komposisinya tidak tertulis atau dirahasiakan oleh
perusahaan tersebut.
Buffer digunakan untuk menjaga keseimbangan ion dan PH di dalam larutan pengencer. pH
optimal dari pengencer semen adalah 6,75 sampai 7,5; osmolalitas optimum adalah 300 sampai
325 mOsm. Penggunaan zwitterionik buffer seperti tris (hydroxymethil) aminomethane (TRIS),
dan potassium buffer, seerti potasium hydroxide, telah dilaporkan pada pengencer semen anjing.
Sodium sitrat mengikat logam berat pada plasma seminal.

Glukosa, dekstrosa, dan laktosa telah telah dijelaskan sebagai sumber energi pada penegncer
semen anjing. Cairan seminal anjing mempunyai konsentrasi fruktosa yang sangat rendah
dibandingkan cairan seminal pada spesies lain, kemungkinan disebabkan karena anjing jantan
tidak mempunyai vesikula seminalis. Fruktosa dapat digunakan sebagai sumber energi pada
spermatozoa anjing.
Kuning telur dan gliserol adalah komponen yang paling sering digunakan dalam pengencer
semen anjing untuk melindungi spermatozoa dari cold shock dan kerusakan selama pembekuan
dan thawing. Persentase spermatozoa motil ynag progresif sesudah pembekuan adalah tertinggi
dengan menggunakan pengencer yang mengandung kuning telur 20 % dari volume,
dibandingkan dengan 5 atau 10 %. Gliserol mempunyai berat molekul rendah sehingga dapat
memasuki sel spermatozoa dan mengikat air intraseluler, menurunkan pemebentukan es
intraselluler dan membantu menghilangkan air dari sel secara perlahan.
Pengawetan semen dengan pendinginan
Persentase sperma motil yang progresif pada sampel yang diawetkan dengan pendinginan pada
4 sampai 5C menurun secara gradual dengan waktu. Penurunan motilitas yang nyata terjadi
lebih cepat pada pengencer yang mengandung 20% kuning telur dari pada pengencer susu skim.
Jika susu skim digunakan harus dipanaskan 92-95 C selama 10 menit untuk denaturasi enzim
dalam susu. Untuk mengoptimalkan angka kebuntingan, pengawetan semen anjing dengan
pendinginan terbaik digunakan dalam 48 jam setelah koleksi. Semen anjing biasanya diawetkan
pada rata-rata 1 bagian semen ke 2-3 bagian pengencer.
Tahapan untuk mendinginkan semen :
Pertama kali dilakukan evaluasi dari kesehatan reproduksi pejantan dengan pemeriksaan fisik
lengkap dan evaluasi semen, termasuk kultur semen dan serologi Brucella canis, dan uji untuk
gangguan genetik yang khusus untuk ras tersebut. Koleksi semen dapat dilakukan dengan
masturbasi pada anjing.
Kemudian pisahkan fraksi kedua (yang kaya spermatozoa) dengan mengganti tabung selama
koleksi. Encerkan fraksi yang kaya sperma dengan pengencer I (lihat tabel) pada temperaur
kamar, pada rasio 1 bagian semen dengan 2 bagian pengencer. Simpan semen yang telah di
encerkan di dalam tabung sentrifus dan utup yang rapat. Masukkan pada kotak styrofoam yang
lebih besar dengan 2 ice pack beku, bungkus dengan koran. Kirin ke tempat betina yang
membutuhkan sesegera mungkin, idealnya dalam waktu 24 jam.
Pengiriman dapat dilakukan dengan thermos es yang diisi dengan pecahan es. Tabung sentrifus
plastik yang telah diisi semen tersebut ditutup rapat kemudian dilindungi dengan
menempatkanya didalam kantung yang tertutup, seperti kantung plastik dengan tabung yang
berisi semen kemudian ditempatkan dalam thermos diatas pecahan es dan kemudian ditutup yang
rapat. Semen harus dengan hati-hati dihangatkan lagi ke suhu 30-35 C sebelum digunakan
untuk inseminasi.
Pengawetan semen dengan pembekuan
Penggunaan semen beku untuk IB pada anjing tidak seluas seperti pada sapi atau kuda. Anjing
jantan harus mempunyai kualias semen ynag sangat bagus dan betina yang akan diinseminasi

dengan semen tersebut harus sudah dewasa dan tidak ada gangguan infertilitas atau penyakit
pada saluran reproduksinya.
Semen dapat dibekukan di dalam ampul, dalam straw atau dalam pelet. Pelet dibuat dengan
mendinginkan semen yang diencerkan dimasukkan kebagian 50-100l ke dalam solid dry ice, da
kemudian disimpan dalam vial nylon yang berlubang pada nitrogen cair. Straw polyvinylchloride
(PVC) bervolume 0,25 atau 0, 50 ml dapat diisi dengan semen yang telah diencerkan dan
didinginkan, tutup pada ujung akhir dan tutup pada bagian lain, diuapkan diatas uap nitrogen cair
dan kemudian straw dimasukkan ke dalam nitrogen cair.
Rata-rata pemebekuan semen anjing yang optimal tergantung pada pengencer dan krioprotektan
yang digunakan dan volume dari sampel. Nilai rata-rata pemebkuan dilaporkan bervariasi dari 1,
89 C ke 5 C permenit sampai sampel mencapai - 5C, kemudian 10C ke 20 C per menit
sampai sampel mencapai - 100C, sesudahnya sampel dimasukkan ke dalam nirogen cair.
Menjelang penyimpanan jangka panjang semen beku, sempel dari pelet aau straw yang
mengandung semen beku yang telah di masukkan ke nitrogen cair paling tidak 5 menit kemudian
harus di thawing dan dievaluasi untuk mendapatkan kualitas semen posthawing. Motilitas
progresif adalah parameter yang paling sering dinilai untuk evaluasi kualitas spermatozoa anjing
yang dithawing setelah pembekuan. Persentase spermatozoa motil yang progresif menurun
setelah thawing, dengan nilai yang dilaporkan adalah kurang lebih 50-60%.
Total konsentrasi 100x 106 spermatozoa/ ml digunakan secra rutin untuk pembekuan. Tetapi
sewaktu semen dengan kuaitas yang tinggi separuh dari konnsentrasi tersebut, misalnya
50x106spermatozoa dapat digunakan. Dosis IB dari 100-150 juta spermatozoa hidup telah
dihubungkan dengan angka konsepsi 75% atau lebih tinggi, tergantung pada kesehatan
reproduksi anjing betina waktu inseminasi , dan penempatan semen dalam saluran reproduksi
betina.
Metode pembekuan semen anjing telah banyak dilaporkan termasuk teknik menggunakan
pengencer dan material. Salah satunya adalah semen yang sudah diencerkan dimasukkan
langsung kedalam nirogen cair dan teknik menggunakan methanol sebagai media pembekuan.
Tahapan untuk memproduksi semen beku :
Setelah anjing jantan dievaluasi kesehatan reproduksinya lengkap seperti pada proses untuk
pendinginan semen. Pisahkan fraksi yang kaya spermatozoa dengan mengganti tabung selama
koleksi. Tambahkan pengencer I, pada suhu kamar, pada perbandingan 1:1. Tempatkan pada suhu
refrigerator selama 1 jam. Label 0, 5 ml straw dengan memberikan nomor identitas, nomor
hewan, ras, dan tanggal. Tambahkan 2 bagian pengencer II, pada suhu refrigerator , pada empet
bagian 0,5 ml selama periode 45 menit untuk konsentrasi final gliserol 4%. Isi straw 0,5 ml,
masukkan gelembung udara untuk mencegah ledakan sumbat selama pembekuan, tutup straw ,
dan tempatkan di suhu refrigerator selama paling tidak 1, 5 jam. Isi dasar dari kotak styrofoam
dengan nitrogen cair. Tempatkan straw pada rak 5 cm di atas permukaan nitrogen cair selama 6
menit, kemudian jatuhkan straw ke dalam nitrogen cair. Sesudah paling tidak 5 menit, pindahkan
ke kontainer dan thawing satu straw (60 detik pada waterbath 37 oC) untuk menilai kualitas
semen post-thawing. Pengiriman sampel semen dalam kanister yang mengandung nitogen cair

atau uap nitrogen cair dalam dry shipper. Yang terakhir akan bertahan selama 1-3 minggu ;
recharge kanister pada saat kedatangan ditempat tujuan atau timbang setiap hari untuk
mengetahui berkurangnya nitrogen cair dan mungkin hawing satu straw. Informasi yang harus
dikirim dengan semen termasuk petunjuk thawing, jumlah spermatozoa dalam setiap straw, dan
persentase progresif motilitas setelah thawing.
Pengencer untuk pendinginan semen : komponen diencerkan dalam 1000 ml air
Pengencer 1:14, 5 gr Na sitrate ; 12,5 g dekstrose; 250 ml kuning telur; 1000 U/ml K penicillin;
1000g/ ml streptomisin.800 gr cream (12 % lemak); 200 gr kuning telur ; 1000 U ml benzyl
penicillin, 1 mg/ml dihydrostreptomycin.Pengencer untuk semen beku : komponen diencerkan
dalam 1000 ml air
Pengencer II:14, 5 gr Na sitrate ; 12,5 gr dekstrose; 250 ml kuning telur; 1000 U/ml K penicillin;
1000g/ ml streptomisin; 80 ml gliserol 29 gr TRIS; 13,2 gr sodium sitrate; 12,5 gr fruktosa; 200
ml kuning telur; 80 ml gliserol
Thawing
Straw di thawing dalam water bath (thermos) pada 70C selama 8 detik. Sesudah thawing, straw
harus dipegang secara vertikal, ujung filter dibawah dan penutup (segel ) di atas, kemudian
diketok dengan jari agar gelembung udara ditengah straw berpindah keatas. Straw dipotong pada
segelnya dan satu tetes semen ditempatkan pada mikroskop slide pada temperatur 37 C dan
periksa dengan mikroskop untuk mengetahui kualitas sesudah thawing. Sering spermatozoa perlu
beberapa waktu untuk mulai bergerak sesudah thawing, tetapi 2 menit pada plat penghangat
sudah cukup untuk mengembalikan motilitasnya.
Pengenceran semen terdiri dari buffer, lemak, nutrisi, antibiotic dan gliserol:

Buffer berguna mengontrol pH (yang berupa buffer ialah sodium sitrat, kuning telur, dll)

Lemak : melindungi membran sitoplasma dari suhu (susu skim dan kuning telur)

Nutrisi : mempertahankan metabolisme sel spermatozoa (glukosa dan fruktosa)

Antibiotic : menekan pertumbuhan bakteri (penisilin dan gentamisin sulfat)

Gliserol : melindungi spermatozoa ari efek merusak dari proses pendinginan

Sitrat : memperbaiki daya hidup spermatozoa, sebagai pengganti penyanggah fosfat

dalam pengenceran kuning telur yang berguna untk preservasi daya hidup dan fertilitas
spermatozoa (Anonim., 2008).

Kandungan Komposisi Semen

Komposisi semen murni :

Fructosa : berguna bagi spermatozoa sebagai sumber energi dalam bergerak.

Asam nitrat : menggumpalkan semen setelah ejakulasi

Spermin : memberikan bau khas pada sperma.

Seminim : merombak lisis sehingga semen mengencer

Prostaglandin : untuk melancarkan pengangkutan spermatozoa dalam saluran kelamin

jantan dan betina

Elektrolit terutama Na, K, Zn, Mg untuk memelihara ph plasma seman

Enzim pembuahan, inhibitor, hormon dan asam amino serta protein (Anonim., 2008).

Analisis sperma :

Bau saat normalnya khas, tajam dan tidak berbau

Warna normal yakni seperti lem, kanji atau putih kelabu

Volume ; semen pada sapi dan domba mempunyai volume rendah tetapi konsistensinya
tinggi, sedangkan semen kuda dan babi merupakan cairan yang lebih voluminous tetapi
dengan konsentrasi sperma rendah.

Koagulasi ; semen normal setelah ejakualsi segera menggumpal. Bila langsung encer
ketika ditambpung berarti ada gangguan pada vesikula seminalis

Viskositas ; kekentalan semen diperiksa dengan alat yang disebut viscometer. Secara
sederhana dapat dilakukan dengan jalan mencelupkan batang kaca ke objek yang sudah
ditetei semen, diangkat pelan diukur tinggi benang yang terjadi antra batang kaca dan
objek sampai batas putus, dan normalnya 3 5 cm.

PH ; semen diteteskan dengan batang kaca pada kertas PH berukuran warna petunjuk,
dan setiap spesies warna tersebut berbeda beda.

Motilitas ; Jumlah yang bergerak maju ialah jumlah spermatozoa semua dikurangi jumlah
mati. Dianggap normal jiak motil laju > 40 %. Menurut Rehan et al. yang normal %
motilnya ialah 63 16 SD dengan range 10 95, namun penelitian melaporkan
spermatozoa yang tidak bergerak belum tentu mati, mungkin ada sesuatu zat cytotoxin
atau antibody yang membuat nya tidak bergerak.

Morfologi ; Semen diwarnai dengan giemsa untuk melihat morfologinya, faktor yang
membuat abnormal : penyakit alergi, terlalu sering ejakulasi, gangguan pada epididimis,
stress dan gangguan hormonal dan saraf (Wildan., 1992).

Pada kancil warna semennya kekuningan, densitas kental, volume 30l, konsentrasi
102.7517.8x106 spermatozoa/ml, motilitas 401.1%, abnormalitas 21.031.05%, viabilitas
639.3%. Seminal plasma kancil mengandung protein 65 mg/100ml, 10,2-11.5 mg/100ml
fruktosa, 22.07-24.5 mg/100ml sorbitol, 35.03-40.12 mg/100mlasam sitrat, 91.1-94.7 mg/ 100ml
sodium, 0.1 mg/100ml potasium, 12.8-124.4 mg/100ml kalsium, 0.8-126.6 mg/100ml
magnesium dan 10.17-11.2 mg/100ml khlorida. Pada SDS PAGE ditemukan sebanyak masingmasing 11 protein pada kisaran 15-218 kDa, dan pada kisaran 38-296 kDa.
Morfologi spermatozoa kancil mirip dengan spermatozoa ruminasia atau hewan domestik
umumnya. Kepala pada spermatozoa berbentuk pipih dengan ujung membulat berukuran panjang
5.6m dan lebar 4.8m. Panjang keseluruhan spermatozoa (kepala-ekor) pada kancil yaitu
36.52m. Berdasarkan ukuran, spermatozoa kancil adalah yang terkecil diantara hewan
ruminansia. Akrosom dan membran spermatozoa kancil masing-masing mengandung senyawa
yang berperan pada proses fisiologis spermatozoa, yaitu senyawa karbohidrat dengan residu gula
galaktosa 1-3 dan D-N-Asetilgalaktosamin dan karbohidrat dengan residu gula D-NAcetilglukosamin dan sialic acid.
Pada uji daya tahan/daya hidup, pada spermatozoa dengan medium tris-kuning telur yang
disimpan pada 4oC selama 5 hari, motilitas spermatozoa hilang pada hari pertama penyimpanan,
sedangkan viabilitas masih ditemukan sampai dengan hari kelima penyimpanan. Pada percobaan
fertilisasi in vitro antara spermatozoa kancil dengan oosit mencit, terlihat spermatozoa kancil
dapat memasuki oosit (tanpa zona pelusidal) dan membentuk pronukleus (http://web.ipb.ac.id/).

DAFTAR PUSTAKA
Anonim., 2008. Reproduksi dan Konservasi Hewan. Bag.Reproduksi dan Kebidanan.
FKH.UGM. Yogyakarta.
Herdiawan., 2004. Pengaruh Laju Penurunan Suhu dan Jenis Pengencer Terhadap Kualitas
Semen Beku Domba Priangan.
Wildan, Yatim. Reproduksi dan Embriologi.1994. Tarsito. Bandung.
http://web.ipb.ac.id/
Diposkan oleh andhie Risw di 20.20